铁筷子(Chimonanthus praecox L. Link.)为腊梅科腊梅属植物腊梅及山腊梅的干燥根，是苗族人民用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的传统用药[1]。前期研究表明铁筷子醇提物可以减轻佐剂性关节炎(AA)大鼠足肿胀，对RA具有一定的治疗作用。本研究以佐剂性关节炎大鼠模型为基础，观察铁筷子醇提物对AA大鼠HIF-1α、VEGF以及MMP-3的影响。
1 材料与仪器 1.1 实验动物SPF级SD大鼠，体质量(200±20 g)，由中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供(动物合格证书编号:2012-0003) 。
1.2 主要药品与试剂铁筷子，采自贵阳市乌当区三江镇农场，经贵阳中医学院药学院生药教研室鉴定为腊梅科腊梅属植物腊梅的根。雷公藤多苷片，福建汇天生物药业有限公司。灭活卡介苗(BCG)，中国卫生部上海生物制品研究所。ELISA试剂盒由海蓝基生物科技有限公司提供。免疫组化抗体由Santa Cruz公司提供。
1.3 主要仪器石蜡切片机CUT4062，德国莱卡；电动匀浆机S25，德国IKA。
2 方法 2.1 铁筷子醇提物浸膏的制备铁筷子用体积分数为0.78的乙醇热回流提取，减压浓缩，蒸干得浸膏。
2.2 完全弗氏佐剂(CFA)及AA大鼠模型的制备高压灭菌后的石蜡油和羊毛脂加入卡介苗，制备成含卡介苗100 g·L-1的完全弗氏佐剂，于大鼠左足跖皮内注射, 复制成AA大鼠模型。
2.3 动物分组及给药72只健康SD大鼠，♀♂各半, 随机分为空白组、模型组、雷公藤组(31.5 mg·kg-1·d-1)、铁筷子醇提物高、中、低剂量组(生药量为7.0、3.5、1.75 g·kg-1·d-1)。
2.4 指标的检测 2.4.1 病理学检测踝关节HE染色，并对病理损伤评分。
2.4.2 血清中HIF-1α的测定根据ELISA试剂盒说明书检测HIF-1α的含量。
2.4.3 滑膜组织中VEGF、MMP-3的检测用免疫组化方法检测VEGF、MMP-3的蛋白表达，并分析其平均光密度的变化。
2.4.4 统计学方法采用SPSS19.0统计软件处理实验数据，计量资料采用x±s表示。
3 结果 3.1 铁筷子醇提物对AA大鼠踝关节病理损伤的影响HE染色结果显示铁筷子醇提物能改善AA大鼠踝关节病理病变情况。根据病理学评分原则进行评分，如Tab 1所示，铁筷子醇提物高、中剂量组可明显降低病理学评分分值 (P＜0.05) 。
| Group | Dosage /mg·kg-1 | Pathological damage score |
| Normal control | - | 1.17±0.98 |
| Model control | - | 11.17±0.75** |
| High-dosage | 664 | 6.83±0.98# |
| Middle-dosage | 332 | 7.67±1.51# |
| Low-dosage | 166 | 9.83±1.17 |
| Tripterygium wilfordii glycosides tablets | 31.5 | 6.67±0.82# |
| **P＜0.01 vs normal control;#P＜0.05 vs model control | ||
如Tab 2所示，铁筷子醇提物各剂量组可降低HIF-1α的浓度，其中高、中剂量组作用明显(P＜0.05) 。
3.3 铁筷子醇提物对AA大鼠滑膜组织VEGF、MMP-3蛋白表达的影响如Tab 2所示，铁筷子醇提物高、中剂量组可明显降低VEGF、MMP-3光密度值(P＜0.05) 。
| Group | Dosage /mg·kg-1 | Concentrations of HIF-1α/μg·L-1 | Optical density value of VEGF | Optical density value of MMP-3 |
| Normal control | - | 1.17±0.13 | 110.74±1.74 | 111.97±1.19 |
| Model control | - | 1.78±0.22* | 188.09±1.01* | 189.88±1.06* |
| High-dosage | 664 | 1.31±0.12# | 140.87±0.87# | 142.83±0.72# |
| Middle-dosage | 332 | 1.39±0.11# | 150.86±1.82# | 152.86±2.55# |
| Low-dosage | 166 | 1.47±0.16 | 170.21±1.19 | 173.07±3.07 |
| Tripterygium wilfordii glycosides tablets | 31.5 | 1.35±0.14# | 142.98±0.46# | 143.93±0.82# |
| *P＜0.05 vs normal control; #P＜0.05 vs model control | ||||
近年在对RA发病机制的研究过程中，滑膜血管新生被认为发挥了重要作用。HIF-1α是低氧状态下血管生成的核心调控因子，主要通过提高VEGF 的表达促进血管生成，从而促进滑膜细胞增殖、活化[2]，VEGF在缺氧条件下能被HIF-1α诱导激活, 导致RA血管生成和滑膜炎症[3]。MMP-3作为金属蛋白酶家族成员之一，是RA的一种重要致病因素。有学者认为在RA过程中，某些细胞因子会使MMP-3得到释放，导致软骨基质的降解，从而破坏RA软骨和骨骼[4]。本实验结果显示，铁筷子醇提物可以降低HIF-1α水平以及VEGF、MMP-3的表达，因此推测铁筷子醇提物通过降低细胞因子水平，减轻了细胞因子对滑膜细胞和软骨细胞的刺激，从而减少滑膜组织中MMP-3的分泌，最终阻止骨质的破坏。
综上所述，铁筷子醇提物能改善AA大鼠关节的病理改变，说明其可以抑制关节炎症，对RA具有一定的疗效。且铁筷子醇提物下调HIF-1α及VEGF、MMP-3的表达可能是其治疗RA的相关机制。
| [1] | 贵州省药品监督管理局. 贵州省中药材,民族药材质量标准 [M]. 贵阳: 贵州科技出版社, 2003, : 457 -8 . Drug Administration in Guizhou. Traditional Chinese Medicinal Materials in Guizhou,National Medicine Quality Standard [M]. Guiyang: Guizhou Science and Technology Press, 2003, : 457 -8 . |
| [2] | Westra J, Molema G, Kallenberg C G. Hypoxia-inducible factor-1 as regulator of angiogenesis in rheumatoid arthritis-therapeutic implications[J]. Curr Med Chem, 2010, 17 (3) : 54-63 . |
| [3] | 吕倩, 王昌明, 蒋明, 等. HIF-1α和VEGF在大鼠COPD 中的表达及与肺血管重构的关系研究[J]. 中国药理学通报, 2012, 28 (6) : 772-7 . Lyu Q, Wang C M, Jiang M, et al. Study on the relationship between the expression of HIF-1α、VEGF in COPD in rats and pulmonary vessel from reconstitution[J]. Chin Pharmacol Bull, 2012, 28 (6) : 772-7 . |
| [4] | Yamanaka H, Matsuda Y, Tanaka M, et al. Serum matrix metalloproteinase-3 as a predictor of the degree of joint destruction during the six months after measurement in patients with early rheumatoid arthritis[J]. Arthr Rheumatol, 2000, 43 (4) : 852-8 doi:10.1002/1529-0131(200004)43:4<852::AID-ANR16>3.0.CO;2-7. |