糖尿病肾病(diabetes nephropathy, DN)是糖尿病引起的一种极高危的慢性微血管并发症，终可发展为终末期肾病(ESRD)，起病隐匿且发展缓慢，具体发病机制尚不明确，是糖尿病患者死亡的主要原因^[1-2]。长期糖代谢紊乱导致大量 AGEs 的形成与蓄积，AGEs 与其受体 RAGE 结合，激活 AGEs-RAGE 信号通路，增强下游细胞因子及生长因子的表达活性，加快纤维化进程，促进DN恶化^[3-4]。肾脏纤维化是 DN病理变化的中心环节及其发展为 ESRD的共同途径^[5]。故有效地抑制 AGEs 的形成及阻断 AGEs-RAGE信号通路的同时，并下调下游细胞因子的表达，不仅可延缓 DN 发展，还能遏制肾脏纤维化这一核心环节，发挥双管齐下的作用，对抑制或逆转DN意义重大。绞股蓝是一种葫芦科中草药，美誉为“南方人参”。 已有研究发现^[6-7]绞股蓝及其制剂具有降血糖、抗纤维化等广泛药理学作用，可干预 DN 多个病理环节，具有保护肾脏的作用。因此，本实验通过观察 GP 对 AGEs 诱导下 HMCs 中RAGE和 TGF-β₁ 表达的影响，初步探讨其在延缓 DN 发生发展中的可能机制，为GP抗DN提供可靠的实验依据。

HMCs(湘雅医学院中心实验室细胞库); DMEM低糖培养基、0.25％胰蛋白酶(美国，Gibco公司) ;晚期糖基化终末产物(AGEs)(美国，Biovision 公司)；胎牛血清 FBS(南美，GEMINI)；GP(标准，质量分数≥98%，每支20 mg)(大连美仑生物技术有限公司)；氨基胍盐酸盐 (Aminoguanidine hydrochloride，AG，美国，Sigma)；TRIzol试剂、逆转录酶试剂盒及 PCR 引物(美国，Invitrogen)；PCR MasterMix及DNA Marker (中国，天根生化科技北京有限公司) ； GAPDH 鼠抗人单克隆抗体(中国, 北京中杉金桥生物技术有限公司); RAGE 兔抗人多克隆抗体(美国，ABGENT 公司)；TGF-β1 兔抗人单克隆抗体(美国，Santa Cruz公司)；CO₂ 细胞培养箱(美国，MENOAI 公司) ; iMark 型酶标仪及 PCR 基因扩增仪(美国，Bio-Rad);TDL-80-2B低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；DYY-6D 型电泳仪(北京市六一仪器厂)。

将HMCs接种于体积分数为0.15的FBS的DMEM低糖培养液，在37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中进行常规培养，显微镜下观察细胞贴壁面积达培养瓶的80%～90%时，用0.25%胰酶消化传代培养，取3~6代生长良好的细胞进行实验。

AGEs与体积分数为0.15的FBS的DMEM低糖培养液配制成浓度为200 mg·L^-1的培养液，再加入不同剂量的GP，分别配制终浓度为25、75、175 mg·L^-1的培养液，4℃保存备用。将阳性药物氨基胍配制成终浓度为10^-1 mmol·L^-1的溶液，-20℃保存。

将对数生长期的HMCs以每瓶5×10⁵个的数量接种于一次性培养瓶，在 37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h后，采取随机化原则分组：正常组(体积分数为0.15的FBS的DMEM低糖培养液)；模型组(200 mg·L^-1 AGEs)；GP组(25、75、175 mg·L^-1)；阳性对照组(氨基胍10^-1 mmol·L^-1)。

用0.25％胰酶消化各组细胞后，分装至1.5 mL EP管，再分别加入150 μL细胞裂解液，置于冰上裂解30 min，反复吹打，充分裂解细胞。4℃，12 000 r·min^-1，离心20 min后，收集上清并测定各组蛋白浓度。取30 μg蛋白，加入适量5×Buffer上样缓冲液，沸水煮5～10 min使其完全变性，-80℃保存备用。制12%分离胶与5%浓缩胶，电泳100 V，2 h后，4℃恒流，260 mA，转膜90 min将蛋白转至PDVF膜上。用含5%脱脂牛奶的 TBST 封闭2 h后，TBST 洗膜3次, 加入一抗(GAPDH鼠抗人单克隆抗体、RAGE兔抗人多克隆抗体及TGF-β₁兔抗人单克隆抗体)4℃孵育过夜，TBST 洗膜3次，再加入相应二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，在暗室加适量 ECL发光，覆上胶片、显影及定影。扫描底片，采用 Quantity One分析灰度值，得出相应蛋白的相对表达量。

取生长良好的HMCs按每瓶5×10⁵个的数量种植于一次性培养瓶。根据TRIzol法提取各组细胞总 RNA 并检测浓度。依照逆转录试剂盒使用书合成 cDNA，以 cDNA为模板，进行PCR扩增。反应总体系为25 μL。由Invitrogen公司合成引物，引物序列如下：RAGE:上游5′-TGGGATGGAAGTGCAGAGGT-3′；下游5′-TGGCGGTTTCCAAGACATTC-3′; TGF-β₁：上游5′-CGTCTGCTGAGGCTCAAGTTA-3′；下游5′-CACAACTCCGGTGACATCAAA-3′; GAPDH：上游 5′-CAGGAATGGAAAGGAGACCAA-3′；下游 5′-TAGCTTCCCTCCGACACACA-3′。PCR的反应条件为：预变性94℃、3 min，94℃变性、30 s、退火温度1 min(RAGE 退火温度：57℃；TGF-β1 退火温度：59.3℃；GAPDH退火温度：59℃)，复性72℃、1 min，共30次后，再延伸72℃、5 min。分别取5 μL PCR产物，加样于2％琼脂糖凝胶点样孔，电泳30 min，置于凝胶成像分析仪观察结果并拍照，运用 sensiAnsys 凝胶图像分析软件分析电泳图像，测量各条带的灰度值，得出各因子 mRNA 的相对表达量。

采用 SPSS 18.0软件分析处理实验数据，组内、组间两两比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，实验数据用x±s表示。

由Fig 1~2可见：体外培养条件下，HMCs 内 RAGE 及 TGF-β₁ 蛋白低表达，AGEs 刺激能促使其异常高表达。与正常组比较，模型组 HMCs 内 RAGE 及 TGF-β₁ 蛋白表达明 显上调，同时各GP组及阳性对照组RAGE及TGF-β₁蛋白表达量明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.01) 。给予GP及阳性药物氨基胍干预后，可明显下调 RAGE 及 TGF-β₁蛋白表达水平，与模型组比较，各GP组及阳性对照组RAGE及TGF-β₁蛋白表达量下调，且各GP组呈浓度依赖性下调 RAGE 及 TGF-β₁表达量，差异具有统计学意义(P＜0.01) 。

Fig 1 Effect of gypenosides on expression of RAGE protein in HMCs A: Normal group；B:Model group(AGEs 200 mg·L-1)；GP group(C:25、D:75 mg·L-1;E:175 mg·L-1); F:Positive control group(AG 10-1 mmol·L-1).**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group

图选项

Fig 2 Effect of gypenosides on expression of TGF-β1 protein in HMCs A:Normal group；B:Model group(AGEs 200 mg·L-1)；GP group(C:25 mg·L-1；D:75 mg·L-1；E:175 mg·L-1)；F: Positive control group(AG 10-1 mmol·L-1).**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group

图选项

由Fig 3~4可见：正常组HMCs内RAGE及TGF-β₁ mRNA低表达。AGEs 诱导HMCs 72 h后，与正常组比较，模型组RAGE及TGF-β₁ mRNA表达量明显增高，各GP组及阳性对照组RAGE及TGF-β₁ mRNA表达量也上调，差异具有统计学意义(P＜0.01) 。给予GP干预后，可明显下调RAGE及TGF-β₁ mRNA表达，与模型组比较，各GP组及阳性对照组RAGE及TGF-β₁ mRNA表达量下调，且各GP组呈浓度依赖性下调RAGE及TGF-β₁ mRNA表达量，差异具有统计学意义(P＜0.01) 。

Fig 3 Effect of gypenosides on expression of RAGE mRNA in HMCs A:Normal group；B:Model group(AGEs 200 mg·L-1)；GP group(C:25 mg·L-1；D:75 mg·L-1；E:175 mg·L-1)；F: Positive control group(AG 10-1 mmol·L-1).**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group

图选项

Fig 4 Effect of gypenosides on expression of TGF-β1 mRNA in HMCs A:Normal group；B:Model group(AGEs 200 mg·L-1)；GP group(C:25 mg·L-1；D:75 mg·L-1；E:175 mg·L-1)；F: Positive control group(AG 10-1 mmol·L-1).**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group

图选项

DN是糖尿病并发症中危害最大的慢性血管病变之一，已成为 ESRD 主要的致病原因。其病理特点为肾小球肥大，基底膜增厚及细胞外基质(ECM)异常堆积，终发展为肾小管间质纤维化等，导致肾功能衰竭^[8-9]。

肾小球系膜细胞(GMC)是肾小球中最为活跃的固有细胞，也是肾脏纤维化进程中产生纤维化因子的主要靶细胞^[10]。长期慢性高血糖环境下，体内蛋白质与还原糖可形成一种不可逆的非酶糖基化终末产物(AGEs)，不仅是 DN发展最关键的始动因子，还与肾脏纤维化发展有着密切联系。既往研究发现^[11-12]，当系膜细胞受到外源性 AGEs 刺激后，可直接导致系膜细胞增生，基底膜增厚及细胞外基质(ECM)过度聚集，最终导致肾小球硬化或小管间质纤维化等病理性改变。此外，还可通过与其系膜细胞上特异性受体(RAGE)结合，激活 AGEs-RAGE 通路，诱导并增强下游TGF-β₁及其他致纤维化细胞因子的表达，加快纤维化进程，促进DN恶化^[13]。

肾脏纤维化是各种肾脏疾病的共同病理基础，也是慢性肾功能衰竭的必经途径，其发展程度与肾功能的关系极为密切，能可靠地反映DN的预后^[14]。目前认为，在肾脏纤维化病程中主要致纤维化因子包括TGF-β₁、PDGF、VEGF及CTGF等。其中，TGF-β₁是 DN 纤维化病程中研究最多、致纤维化作用最强的细胞因子，在 DN 发生发展中发挥重要作用^[15]。TGF-β₁不仅可直接介导 DN 纤维化病理改变的核心环节，还可通过受体信号参与调节细胞增殖、分泌、凋亡及肾小球硬化等多个病理过程^[16-17]。

DN时多种因素可诱导TGF-β₁表达异常升高，TGF-β₁可刺激细胞外基质(ECM)合成增加，进而引起系膜区扩张、基底膜增厚，导致弥漫性或结节性肾小球硬化^[18]。李业琼等^[19]研究发现DN大鼠中AGEs 的聚集增加，还可诱导 RAGE 异常高表达，参与DN的发生发展。本研究显示^[20]： AGEs 诱导刺激 HMCs 中 RAGE 高度表达，并上调下游因子 TGF-β₁ 活性。已有研究表明，抑制 TGF-β₁ 表达活性，在一定程度上可减轻和延缓肾脏纤维化进展，对防治DN具有重要意义。

近年来，中药在 DN 治疗方面颇具特色，并取得了一定疗效。GP 是一种名贵的中草药，称之“第二人参”。不断有研究表明，GP 在降血糖及改善糖尿病并发症方面具有明显作用^[21]。陶利花等^[22]观察了绞股蓝皂苷对糖尿病模型的相关基因表达，发现绞股蓝皂苷可抑制AGEs及RAGE，降低TGF-β₁活性，用于糖尿病肾病早期治疗。王雁秋等^[23]发现绞股蓝皂苷可抑制糖尿病肾脏VEGF表达，具有保护肾脏的作用。由此可见，绞股蓝皂苷对糖尿病肾病纤维化有一定的抑制作用。

本课题组前期研究发现，GP能抑制AGEs诱导下HMCs增殖及ECM堆积，改善氧化应激水平，延缓DN发展进程^[24-25]。进一步研究发现，给予不同剂量GP及阳性药物氨基胍干预后，可明显下调HMCs中RAGE及TGF-β₁ mRNA及蛋白的异常高表达，且呈浓度依赖性。故可推测 GP 可通过阻断 AGEs-RAGE 信号通路，下调致纤维化因子TGF-β₁的表达，从而延缓DN纤维化进程。氨基胍是目前研究中认为作用最强的AGEs抑制剂之一，可阻断AGEs-RAGE信号通路，但因其毒性较大，未能用于临床治疗^[26]，故作为本实验阳性对照。

目前，GP抗纤维化机制的文献报道多来源于动物实验，关于GP 抗纤维化的基础实验鲜有报道。因此，本实验采用 AGEs 体外培养的HMCs为研究模型，同时给予不同浓度GP进行干预，观察 GP对AGEs诱导下HCMs中RAGE及TGF-β₁表达的影响，初步探讨其在延缓DN发生发展中的可能机制。

综上所述，GP可抑制AGEs诱导下HMCs中RAGE的异常表达，同时降低 TGF-β₁的活性。由此推测GP可发挥类似于氨基胍的作用，抑制AGEs的形成及阻断AGEs-RAGEs信号通路，并下调致纤维化因子TGF-β₁的活性表达，从而延缓肾脏纤维化发展进程，为防治DN发展提供新的策略。此外，GP是否还可通过阻断其它机制，如 NF-κB、PKC等信号通路，从而延缓 DN 纤维化进展，仍待研究证实。本实验仅从体外基础实验论证具有局限性，应结合动物实验及临床实验，为GP 在早期预防及治疗DN 纤维化发展提供更多可靠的理论依据。

( 致谢: 本实验在桂林医学院科学实验中心完成，感谢实验室老师们对本实验的指导和帮助！ )