神经母细胞瘤是儿童最常见的恶性肿瘤之一。因其恶性程度高，手术加化疗的方案对于侵润性的神经母细胞瘤效果不佳。砷，俗名砒霜，很早被用来治疗急性粒性白血病。现在发现砷对神经母细胞瘤、胶质瘤，以及来源于肝脏、前列腺、肾脏、子宫颈和胆囊等固体肿瘤也有效[1]。然而，其作用机制尚未完全明了。有报道，肿瘤细胞H2S合成酶表达上调[2]。那么，砷是否可通过下调H2S合成酶的表达发挥抗癌作用？本实验采用SH-SY5Y细胞和亚砷酸钠(NaAsO2)对此问题进行了探讨。
1 材料与方法 1.1 材料SH-SY5Y细胞(DSMZ)；胎牛血清(Hyclone)；NaAsO2、MTT(Sigma)；3MST、β-actin一抗及二抗(Santa Cruz)。
1.2 MTT检测取对数期生长的细胞培养24 h后加药。NaAsO2组按浓度分为4组(0、15、35、40 μmol·L-1，依据预实验及文献[3])，分别作用24、48、72 h检测。细胞的抑制率/%=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.3 形态观测药物干预后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化。
1.4 Westernblot检测 细胞蛋白上样、电泳、转膜、封闭，加入3MST一抗(1 ∶1 000)及二抗(1 ∶3 000)，ECL显色曝光。
1.5 统计学分析采用SPSS 13.0单因素方差LSD检验，数据用x±s表示。
2 结果 2.1 NaAsO2对细胞生长的影响MTT结果显示，NaAsO2 15~40 μmol·L-1对SH-SY5Y细胞有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性效应，见Tab 1。
| Group | 24 h | 48 h | 72 h |
| Control | 0±3.74 | 0±3.38 | 0±3.21 |
| NaAsO2 15 μmol·L-1 | 15.29±3.74** | 14.09±3.69** | 26.60±5.95** |
| NaAsO2 35 μmol·L-1 | 16.17±2.66** | 21.07±3.31**# | 34.29±4.66** |
| NaAsO2 40 μmol·L-1 | 15.31±3.36** | 25.41±3.08**# | 40.59±4.77**# |
| **P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs NaAsO2 15 μmol·L-1 | |||
倒置显微镜观察 SH-SY5Y 细胞经NaAsO2 15~40 μmol·L-1处理24、48、72 h后，细胞体积缩小，胞体变圆，细胞间隙变宽，随着亚砷酸钠浓度升高和作用时间的延长，细胞生长变缓，贴壁能力下降，细胞数目变少。
2.3 NaAsO2对细胞3MST表达的影响Western blot检测发现，NaAsO2 15~40 μmol·L-1作用SH-SY5Y细胞24~72 h后，3MST蛋白表达水平呈剂量依赖性下降，见Tab 2。
| Group | 24 h | 48 h | 72 h |
| Control | 5.84±0.25 | 4.30±1.15 | 3.29±0.32 |
| NaAsO2 15 μmol·L-1 | 5.85±0.44 | 3.26±0.46* | 1.60±0.32* |
| NaAsO2 35 μmol·L-1 | 4.29±0.51*# | 3.57±0.61 | 0.19±0.03* |
| NaAsO2 40 μmol·L-1 | 4.18±1.15*# | 2.89±0.50** | 0.09±0.03**# |
| *P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs NaAsO2 15 μmol·L-1 | |||
目前认为，砷剂可通过产生活性氧、线粒体膜电位的损坏、Bcl-2的下调、caspases的激活来对肿瘤细胞造成毒性损伤[4]；砷还能损伤细胞有丝分裂，引起细胞周期阻滞于G0或G2/M期，诱导微核产生，损伤DNA[3]。本实验发现NaAsO2可抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长、促进瘤细胞损伤，具有抗癌效应。
有报道，H2S促进一些肿瘤细胞生长和增生。在HCT116、HT-29、LoVo直肠癌来源的细胞系，胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)表达上调，且H2S水平升高；而将HCT116细胞CBS基因沉默或药物抑制则降低细胞增生、迁移和侵袭[2]。3MST和CBS虽然均为H2S合成酶，但在神经系统以3MST表达为主[5]。本实验中，SH-SY5Y细胞经砷处理后3MST表达降低，意味着H2S生成减少，这与砷的抗肿瘤作用相一致，提示NaAsO2的抗癌效应可能与3MST表达下调有关，仍需进一步实验加以证实。
| [1] | Pettersson H M, Karlsson J, Pietras A, et al. Arsenic trioxide and neuroblastoma cytotoxicity[J]. J Bioenerg Biomembr, 2007, 39 (1) : 35-41 doi:10.1007/s10863-006-9058-6. |
| [2] | Szabo C, Coletta C, Chao C, et al. Tumor-derived hydrogen sulfide, produced by cystathionine-β-synthase, stimulates bioenergetics, cell proliferation, and angiogenesis in colon cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110 (30) : 12474-9 doi:10.1073/pnas.1306241110. |
| [3] | States J C. Disruption of mitotic progression by arsenic[J]. Biol Trace Elem Res, 2015, 166 (1) : 34-40 doi:10.1007/s12011-015-0306-7. |
| [4] | Emadi A, Gore S D. Arsenic trioxide-an old drug rediscovered[J]. Blood Rev, 2010, 24 (4-5) : 191-9 doi:10.1016/j.blre.2010.04.001. |
| [5] | Kimura Y, Toyofuku Y, Koike S, et al. Identification of H2S3 and H2S produced by 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase in the brain[J]. Sci Rep, 2015, 5 : 14774 doi:10.1038/srep14774. |