2. 内蒙古精神卫生中心，内蒙古 呼和浩特 010010;
3. 鄂尔多斯市中心医院药剂科，内蒙古 鄂尔多斯 017000
2. Inner Mongolia Mental Health Center, Hohhot 010010,China ;
3. Dept of Pharmacy, Erdos Central Hospital,Ordos Inner Mongolia 017000,China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是多病因诱发的中枢神经退行性疾病，细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)聚集形成老年斑(senile plaque,SP)是AD的明显病理特征[1]。β-淀粉样蛋白是一种神经毒性物质，被认为是神经元凋亡的诱导因素，在AD的发病中起着重要的作用。近年研究表明，Aβ可通过诱导凋亡相关基因，如Bcl-2、Bax、p53等表达改变，从而导致神经元缺失[2]。Bcl-2蛋白家族及其家族成员共同构成一个异常复杂的相互作用网络，调控细胞凋亡。其调节细胞凋亡的机制可能与Bcl-2蛋白家族与线粒体、Bcl-2蛋白的相互作用、细胞内Ca2+及氧自由基有关。然而，在表观遗传学方向的研究鲜有报道。
DNA甲基化修饰是最早发现的基因修饰方式之一，是人类表观遗传学研究的一项非常重要的内容。DNA的甲基化修饰主要是发生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶上，其主要过程是在CpG甲基化结合蛋白(methyl-CpG binding proteins,MBDs)和DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的作用下，将甲基从S-腺苷蛋氨酸(SAM)转移到胞嘧啶的5’端，使CpG 二核苷酸的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。DNA 甲基化可使基因发生沉默，降低其表达水平，而去甲基化改变则与之相反，可使已甲基化沉默的基因重新获得表达[3]。DNA甲基化调控致病基因的表达在AD中的研究已有一些报道，主要集中在DNA甲基化在Aβ生成、清除及毒性相关基因的调控[4-5]。一方面，AD 发病的相关基因β-淀粉样前体蛋白(β-APP)裂解酶(BACE)等低甲基化，表达增加；另一方面，抑制AD发病的基因(如NEP)高度甲基化，表达减少，最终导致β-淀粉样肽过量产生和沉积。然而，Aβ下游靶基因的表观遗传学调控鲜有报道。因此，对Aβ调控凋亡相关基因表达的表观遗传学机制的研究，可以为阐明AD的发病机制提供理论依据，为治疗和预防AD提供新的思路和方法。
1 材料与方法 1.1 仪器细胞培养箱(150i,Thermo)；酶标仪(Bio-Rad Model680,美国)；倒置显微镜(SN-CJ-αFD,Leica)；低温高速离心机(3-18K,Sigma)；电泳仪(DYCZ-40D,北京市六一仪器厂)；Real-time RT-PCR仪(PikoReal 96,Thermo Scientific)；全自动凝胶成像系统 (Upland CA,美国)；Odyssey双色红外荧光成像系统(Odyssey clx LI-COR,美国)。
1.2 试剂人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株(北京协和细胞资源中心)；MTT试剂(Sigma)；Aβ25-35(吉尔生化有限公司)；改良型RPMI 1640培养基(Hyclone)；FBS(Gibco)；引物(上海生工生物工程股份有限公司)；单克隆抗体Bax(ab32503,Abacm)；Bcl-2(ab32124,Abacm)；二抗β-actin(TA-09,ZSGB-BIO)；RNAsimple Total RNA Kit(Tiangen,China)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific,USA)；QuantiFast SYBR Green PCR Kit(Quigen,Germany)；TIANnmp Genomic DNA Kit(DP304-02,Tiangen)；EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)。
1.3 细胞培养SH-SY5Y细胞株培养于Hyclone混合培养基(含体积分数为15%的新生牛血清)，于37℃、5%的CO2培养箱中培养，每2～3 d以胰蛋白酶消化1 ∶2传代。取对数生长期细胞进行实验。空白对照组加入正常培养基，实验组分别加入含10 μmol·L-1 和25 μmol·L-1的Aβ25-35的工作液。
1.4 MTT法检测细胞活性取对数生长期细胞，计数并接种于96孔板，分组给药孵育72 h以后，每孔加入5 g·L-1 MTT 10 μL，37℃孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，低速振荡10 min后，酶标仪测定490 nm处各孔的吸光度，实验重复3次。
1.5 Westernblot检测SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达 RIAP缓冲液裂解细胞，考马斯亮蓝结合法进行蛋白质含量定量。加上样缓冲液调到各组蛋白量一致，10% SDS-PAGE电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，转移至PVDF膜(100 V,2 h)，预染蛋白marker确定蛋白分子量标准位置。含5%脱脂奶粉TTBS液封闭1 h，抗体Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 500)分别用封闭液按比例稀释后，4℃孵育过夜。TBST脱色3次，每次10 min；再用TBS脱色3次，每次10 min。荧光二抗(1 ∶10 000) 室温孵育1 h。TBST脱色步骤同上。Odyssey双色红外荧光成像系统摄片。ChemiScope analysis软件分析Bcl-2、Bax与β-actin条带的灰度比值，计算蛋白相对表达量。
1.6 Real-timePCR检测SH-SY5Y细胞DNMTs mRNA表达 根据Total RNA Kit 试剂盒操作说明分别抽提各种细胞的总RNA。取各组RNA各1 μg，进行逆转录反应生成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。具体操作根据QuantiFast SYBR Green PCR Kit试剂盒说明书和PikoReal 96 Real-time RT-PCR仪器操作说明书。PCR反应体系(10 μL):cDNA 1 μL,primer R(10 μmol·L-1) 0.5 μL,primer F(10 μmol·L-1) 0.5 μL,2×Taq PCR MasterMix 5 μL,RNase Free water 3 μL。PCR引物分别为DNMT1:上游 5′-GGTTCTTCCTCCTGGAGAATGTC-3′,下游5′-GTCTGGGCCACGCCGTACTG-3′; DNMT3A:上游 5′-ACCACGACCAGGAATTTGAC-3′,下游 5′-ATGTAGCGGTCCACCTGAAT-3′; DNMT3B:上游 5′-CGACCTCACAGACGACACAG-3′,下游 5′-CAAACTCCTTCCCATCCTGA-3′; MeCP2:上游5′-CCCCACCCTGCCTGAA-3′,下游
5′-GATGTGTCGCCTACCTTTTCG-3′; GAPDH:上游5′-CATCTAGGAGGGCTATGCTC-3′,下游5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′。 PCR反应条件为DNMT1: 预变性，95 ℃ 7 min，变性95 ℃5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸60 ℃ 30s，循环45 次。以GAPDH为内参基因，目的基因的相对表达量=2-△△Ct，其中，ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct内参)实验组-(Ct靶基因-Ct内参)对照组。每个目的基因进行3次重复实验，以Ct值做统计分析。
1.7 甲基化特异性PCR 1.7.1 引物设计通过Gene database online获得目的基因Bcl-2(NC_000018.10)的基因序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)，NCBI寻找目的基因启动子区(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/)预测CpG岛并筛选合适的引物，见Fig 1。Bax引物来自于参考文献。
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| Fig 1 CpG islands prediction and sequence of promoter of Bcl-2 Three CpG islands were predicted with blue.A: Island 1 167 bp(674~840); B: Island 2 155 bp(865~1 019); C: Island 3 884 bp(1 054~1 937) |
依据试剂盒操作提取各组细胞的DNA，取每组DNA 500 ng，采用EZ DNA甲基化试剂盒进行亚硫酸盐修饰，以修饰后的DNA为模板进行PCR扩增(20 μL反应体系) ：模板DNA 200 ng，dNTP(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，上
游和下游引物(10 mmol·L-1) 1 μL(见Tab 1)，MSP DNA Polymerase 2.5 U·μL-1和ddH2O补至20 μL。循环参数：95 ℃预变性5 min；94℃ 20 s，退火温度65℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳(120 V,40 min)，在凝胶图像显像仪下观察结果。
| Gene | Up primer(5′-3′) | Down primer(5′-3′) | Size/bp |
| Bcl-2 methylation | TTTTTTTAGTTTTTGTTTTTATGGC | AAACCTTCTACTCAAACCTACGAC | 171 |
| Bcl-2 unmethylation | TTTTTAGTTTTTGTTTTTATGGTGT | AACCTTCTACTCAAACCTACAAC | 168 |
| Bax methylation | ACGTGACGGGATTAAATTTTTC | AAAAACCCCGCTAAACGT | 102 |
| Bax unmethylation | GTTATGTGATGGGATTAAATTTTTT | AAAAACCCCACTAAACATACA | 118 |
采用SPSS 13.0数据处理软件包处理，数据用x±s表示。两组及多组样本均数比较进行单因素方差分析。方差齐时，两两比较采用T检验法；方差不齐时，两两比较采用卡方检验法。
2 结果 2.1 Aβ25-35降低SH-SY5Y细胞存活率25 μmol·L-1 Aβ25-35作用细胞48 h和72 h以后，细胞存活率分别为(73.25±5.74)%和(68.49±9.83)%；50 μmol·L-1 Aβ25-35作用细胞48 h和72 h以后细胞存活率降低为(59.29±2.84)%和(55.75±6.19)%，与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果显示随着时间和浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，见Fig 2。因此，我们确定Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的最佳浓度和时间为25 μmol·L-1和72 h。
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| Fig 2 Effect of Aβ25-35 on cell viability in SH-SY5Y cells by MTT assay Cells were treated with various concentration of Aβ25-35 for 48 h or 72 h.*P<0.05,**P<0.01 vs control |
经10、25 μmol·L-1 Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞72 h后，Western blot结果显示，Aβ25-35药物组Bax 表达明显增加，条带灰度值明显上升；Bcl-2蛋白表达减少，条带灰度值明显减少，与空白组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见Fig 3。
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| Fig 3 Western blot analysis of Bcl-2,Bax protein relative expression levels after incubation with Aβ25-35 for 72 h in SH-SY5Y cells The data were expressed as x±s from three independent experiments.*P<0.05 vs control. |
采用Real-time PCR技术检测各组细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MeCP2基因表达水平，反应均获得满意的扩增曲线、熔解曲线，见Fig 4。随着Aβ25-35药物浓度的增加，DNMT1、DNMT3b、MeCP2的基因表达均有降低趋势，DNMT3a有增加的趋势，但与空白组比较差异均不具有统计学意义(P>0.05,n=3)，见Tab 2、Fig 5。
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| Fig 4 DNMT1,DNMT3a,DNMT3b,MeCP2 and GAPDH amplification curve and dissolution profile |
| Group | DNMT1 | DNMT3a | DNMT3b | MeCP2 |
| Control | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Aβ 10 μmol·L-1 | 1.232±0.192 | 1.006±0.257 | 1.007±0.198 | 1.041±0.270 |
| Aβ 25 μmol·L-1 | 0.925±0.200 | 1.059±0.078 | 0.839±0.262 | 0.897±0.249 |
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| Fig 5 DNMT1,DNMT3a,DNMT3b and MeCP2 expressions in SH-SY5Y cell by qRT-PCR analysis DNMT1,DNMT3a,DNMT3b and MeCP2 mRNA transcript levels in SH-SY5Y cells were normalized against GAPDH |
MSP结果显示，正常对照组SH-SY5Y细胞Bcl-2基因启动子区甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性；10、25 μmol·L-1 Aβ25-35药物组Bcl-2基因启动子区甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性，见Fig 6。MSP检测Bax启动子区甲基化结果显示，正常对照组SH-SY5Y细胞Bax 基因启动子区甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性；10、25 μmol·L-1 Aβ25-35药物组Bax 基因启动子区甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性，见Fig 6。
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| 图 6 中文标题 Fig 6 Methylation-specific PCR analysis of methylation of Bcl-2 and Bax genes promoter A：Control;B：10 μmol·L-1 Aβ25-35;C:25 μmol·L-1 Aβ25-35.Methylation was detected by the presence of PCR product amplified by methylation-specific primers in the Meth lane; demethylation was detected using PCR products amplified with unmethylated-specific primers in the Ume lane.UM:unmethylated; M:methylation |
DNA的甲基化修饰在调控基因的表达、个体的发育和各种疾病中扮演着重要的角色。邓钰双等[6]研究发现，AD患者全脑基因的甲基化水平较同龄非AD患者降低，并且这种异常修饰与AD致病基因的表达相关。特定基因启动子区甲基化程度异常及全基因组甲基化程度减低均与AD的发生有着密切关系[7]。在凋亡通路的组成成分中，部分是基因产物，受DNA甲基化表观遗传修饰的影响[8]。项梦琦等[9]研究结果表明，腺苷(adenosine,ADO)联合同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)可通过抑制甲基转移酶、降低细胞内甲基化代谢作用而活化抑癌基因p53，并诱导肝癌细胞凋亡。
Bcl-2 是第一个被发现与凋亡相关的基因，它编码26 ku的蛋白定位于线粒体膜、核膜和内质网，它的过度表达能抑制细胞凋亡。Bax是Bcl-2家族的一个成员，在决定细胞死亡或生存扮演着关键的角色。特别是，Bax和Bcl-2蛋白质含量之间的平衡对细胞凋亡的调节很重要。本实验结果显示，Aβ25-35引起的细胞凋亡伴随着Bcl-2蛋白表达减少，Bax 蛋白表达增加。目前有研究证实，在疾病状况下Bcl-2启动子区甲基化程度升高引起表达下调[10]。曾慧卉[11]研究发现，慢性阻塞性疾病患者肺组织中Bcl-2基因启动子区存在异常甲基化，且该异常甲基化与吸烟指数、肺血管内皮细胞凋亡均相关。此外，在结直肠癌和晚期前列腺癌组织中Bcl-2基因启动子是低甲基化的，Bcl-2甲基化与组织中 Bcl-2蛋白表达呈负相关[12]，说明Bcl-2基因表达可以受到DNA甲基化的调控。然而，Aβ 介导的细胞Bcl-2、Bax基因甲基化依赖的表观遗传调控在AD的研究中尚无报道。本实验旨在研究细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax是否存在异常表观遗传调控，从而加速了AD的恶性进展。
DNA甲基化所导致的基因失活与基因突变或缺失不同，它不改变DNA序列，且CpG岛去甲基化可直接恢复抑癌基因的表达和功能。由于DNMTs活性的高低是DNA甲基化模式的主要决定因素，抑制DNMTs的活性将会导致甲基化模式的改变，因甲基化而沉默的基因可以重新获得表达，恢复正常的调控功能。迄今为止，哺乳动物细胞DNA 甲基化转移酶主要分为3 个家族：DNMT1、DNMT2 和DNMT3[13]。其中，DNMT1主要在DNA复制和修复过程中维持甲基位点的稳定性[14]。DNMT3a和DNMT3b蛋白是催化从头甲基化形成新的甲基化位点，对未甲基化和半甲基化DNA显示类似的活性[15]。此外，DNMT2几乎没有DNA甲基化催化活性，目前研究较少。MeCP2蛋白质作为转录抑制剂，具有去甲基化活动，它将甲基化胞嘧啶转变为胞嘧啶碱基，从而抑制基因转录[16]。为了研究Aβ是否影响目的基因启动子区甲基化，我们首先通过Real-time PCR技术检测不同浓度Aβ25-35处理组SH-SY5Y细胞中DNMTs的表达。目前结果显示，Aβ25-35对于SH-SY5Y细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MeCP2基因mRNA水平没有明显影响(P>0.05)。由此，我们推测Aβ介导SH-SY5Y细胞Bcl-2表达下调、Bax表达上调并非通过启动子区甲基化的变化。为了进一步验证我们的假设，我们通过在线软件设计了Bcl-2、Bax甲基化引物和非甲基化引物。采用MSP方法检测不同浓度的Aβ25-35作用SH-SY5Y细胞72 h以后，Bcl-2和Bax基因启动该区甲基化状态。MSP结果显示，Aβ25-35药物组与空白组的变化趋势相一致，即 Bcl-2、Bax基因甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性。该结果表明，Aβ25-35介导凋亡未改变Bcl-2、Bax基因启动子区甲基化。这与先前的研究相一致，即Aβ介导细胞凋亡的过程中并未改变DNA甲基化酶的表达。
然而，鉴于MSP方法存在一定的局限性，只能定性分析目的基因启动子区的甲基化，而事实上，基因的甲基化状态改变与某些特定的CpG部位是有关的。Bcl-2基因启动子区的甲基化可能具有不同的易感性，本实验只局限于Bcl-2、Bax基因某一特定启动子区的CpG岛，其他CpG岛甲基化是否影响基因的表达还有待于进一步的验证。针对位点的研究可能带来靶向治疗的进展，未来我们将通过BSP(亚硫酸氢钠处理后测序法)的方法进一步分析CpG区域的甲基化频率来验证我们的实验结果。并通过微阵列技术检测待测的目的基因的每个CpG，以更详细地了解DNA甲基化的CpG区域，这将是我们未来的研究方向。未来还需要通过微阵列技术筛选出受到Aβ影响的启动子区甲基化差异的基因，进而对于某些低甲基化、高表达的AD相关基因可以采用靶向诱导DNA甲基化的方法促进其甲基化过程，抑制基因的表达对于AD的诊断和治疗将产生深远影响。
( 致谢: 所有实验内容于内蒙古医科大学药理实验室完成。特别感谢内蒙古医科大学常福厚教授提供GLP实验仪器的帮助。 )
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