卵巢癌早期即可在腹腔内种植扩散，因其生长隐秘、迅速，约70%的患者初诊时已属晚期，其死亡率在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位，严重威胁着女性的生命健康[1]。据肿瘤干细胞学说，人们推定卵巢癌干细胞可能是卵巢癌发生、转移、侵袭、复发和耐药的根本原因，因此，清除肿瘤干细胞是改善卵巢癌治疗效果的策略之一[2-3]。有研究表明，转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)或两者共同诱导获得肿瘤干细胞特性[4-6]。白杨素(chrysin,ChR)作为一种蜂胶中含量最高的天然黄酮类化合物，近期发现它具有抑制肿瘤干细胞自我更新的作用[7-10]。本文主要检测白杨素是否具有逆转TNF-α处理慢性暴露TGF-β诱导人卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成作用，并探讨其作用机制是否涉及抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活性。
1 材料与方法 1.1 受试物与试剂白杨素购自美国Sigma 公司，用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解，实验组培养体系中DMSO 的最高终浓度为不影响细胞生长速率的浓度(0.1%)。鼠抗人NF-κB(p65)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国Sigma-Aldrich公司。NF-κB(p65) siRNA依据GenBank(基因登记号. M61909)设计；NF-κB(p65) siRNA和乱序对照siRNA购自上海Invitrogen公司。NF-κB(p65) siRNA序列为：5’-GCCTTAATAGTAGGGTAAGTT-3’。乱序对照siRNA序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。Lipofectamine RNAiMAX购自美国Invitrogen公司。TGF-β和TNF-α购自北京义翘神州生物技术有限公司。
1.2 细胞与球培养人卵巢癌OVCAR-3细胞系细胞购自中国科学院细胞库。按照文献[11-12]所述方法，进行细胞培养和球培养，分别得到单层贴壁生长细胞和非黏附克隆性生长的球(球体直径 ≥ 50.0 μm)细胞。
1.3 球形成率测定实验分组设计为Mock组：完全培养基对照组；TGF-β组： TGF-β(5.0 μg·L-1)处理OVCAR-3细胞12 d；TGF-β+TNF-α组：TGF-β(5.0 μg·L-1)处理OVCAR-3细胞12 d，或者在不同浓度白杨素(5、10、20 μmol·L-1)存在或者缺失情况下，TNF-α(10.0 μg·L-1)联合TGF-β(5.0 μg·L-1)处理24 h。分别收集细胞，并以无血清干细胞条件培养基悬浮细胞，调节细胞密度为1×106·L-1，每孔1.0 mL，接种于24孔超低黏附培养板，培养8 d，计数每孔球数目。球形成率计算公式如下：球形成率/% = 每孔肿瘤球均数/每孔接种活细胞总数(1 000个细胞)×100%。
1.4 Western blot实验提取上述处理的OVCAR-3球细胞的全细胞裂解物，测定蛋白含量。按照文献[8]所述方法，以β-actin作为内参对照，Western blot检测NF-κB(p65)蛋白水平。Alpha Imager 2200软件分别测定NF-κB(p65)蛋白信号与β-actin信号的随机灰度单位，并计算两者比值，数据以x±s表示。
1.5 NF-κBp65 siRNA转染 按照文献[8]方法，用DMEM培养基悬浮卵巢癌OVCAR-3细胞，并调节细胞密度为5×107·L-1,每孔2.0 mL，接种于6孔细胞培养板。培养24 h,细胞达到约50%融合，按照供应商说明书的方法和步骤，用Lipofectamine RNAiMAX试剂将50 nmol·L-1 NF-κB(p65) siRNA或乱序对照siRNA(Control siRNA)转染入细胞。转染24 h后进行相应TGF-β(5.0 μg·L-1)、TNF-α(10.0 μg·L-1)、白杨素处理。
1.6 统计学分析各组实验数据录入SPSS 15.0统计软件建立数据库，数据用x±s表示。采用One Way ANOVA方差分析；首先进行方差齐性检验，在方差齐性时，多组均数比较采用LSD法；在方差不齐时，多组均数间比较采用Tukey’s检验。
2 结果 2.1 TNF-α诱导TGF-β慢性暴露卵巢癌OVCAR-3细胞球形成干细胞条件培养基超低黏附板悬浮培养OVCAR-3细胞系细胞8 d，形成非黏附克隆性球。用球形成率测定法对比Mock、TGF-β和TNF-α+TGF-β 3组卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成率。结果显示，与Mock组相比，TGF-β能增高卵巢癌OVCAR-3细胞系肿瘤球形成率，且TNF-α能进一步增强TGF-β诱导卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成能力作用(Fig 1)。
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| Fig 1 Influence of inflammatory factor TGF-β and TNF-α on rate of tumor sphere formation of ovarian OVCAR-3 cells Treatment with TGF-β and TGF-β plus TNF-α increased the rate of tumor sphere formation of ovarian OVCAR-3 cells. *P＜0.05 vs untreated OVCAR-3 cells; #P＜0.05 vs OVCAR-3 cells treated with 5.0 μg·L-1 TGF-β alone. |
采用不同浓度(5.0、10.0、20.0 μmol·L-1)白杨素处理TGF-β+TNF-α组OVCAR-3细胞，球形成率测定法检测细胞自我更新能力作用。Fig 2结果显示，不同浓度白杨素以浓度依赖方式抑制TGF-β慢性暴露合并TNF-α处理诱导卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成作用(P＜0.05)。
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| Fig 2 Effect of chrysin on rate of tumor sphere formation of OVCAR-3 cells induced by inflammatory factor Chrysin suppressed self-renew of ovarian stem-like cells increased by inflammatory factor in a dose dependent manner.*P＜0.05 vs OVCAR-3 cells treated without chrysin;#P＜0.05 vs OVCAR-3 cells treated with 5.0 μmol·L-1 chrysin. |
与Mock组相比，TGF-β组和TGF-β+TNF-α组卵巢癌OVCAR-3细胞NF-κB(p65)蛋白表达增强(Fig 3A)。结果说明TGF-β和TNF-α联合处理能有效地激活人卵巢癌OVCAR-3细胞NF-κB经典信号传导通路。不同浓度白杨素(5.0、10.0、20.0 μmol·L-1)孵育TGF-β慢性暴露合并TNF-α处理的卵巢癌OVCAR-3细胞，抗NF-κB(p65)抗体进行Western blot分析。结果如Fig 3B所示,白杨素以浓度依赖方式抑制TNF-α处理合并TGF-β慢性暴露增高卵巢癌OVCAR-3细胞NF-κB(p65)蛋白表达水平(P＜0.05)。
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| Fig 3 Inhibitory effect of chrysin on expression level of NF-κB(p65) in OVCAR-3 cells increased by inflammatory facto A: Comparison of the expression level of NF-κB(p65) in OVCAR-3 cells cultured with or without the inflammatory factor.*P＜0.05 vs untreated OVCAR-3 cells;#P＜0.05 vs OVCAR-3 cells treated with 5.0 μg·L-1 TGF-β； B: Chrysin significantly reduced the expression level of NF-κB(p65) in OVCAR-3 cells treated with TNF-α and TGF-β in a dose-dependent manner.*P＜0.05 vs OVCAR-3 cells treated without chrysin.#P＜0.05 vs OVCAR-3 cells treated with 5.0 μmol·L-1 chrysin. |
与乱序对照 siRNA转染细胞比较，NF-κB(p65) siRNA转染下调TGF-β和TNF-α联合处理诱导卵巢癌OVCAR-3细胞NF-κB(p65)蛋白表达(Fig 4A)和抑制球形成(Fig 4B)。同时，NF-κB(p65) siRNA转染协作白杨素抑制TNF-α处理合并TGF-β慢性暴露诱导卵巢癌OVCAR-3细胞自我更新和NF-κB(p65)蛋白表达水平增高作用。
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| Fig 4 Inhibitory effects of chrysin enhanced by NF-κB (p65) siRNA A: NF-κB(p65) siRNA enhanced chrysin downregulating NF-κB(p65) expression in OVCAR-3 cells; B: NF-κB(p65) siRNA potentiated inhibitory effect of chrysin on the rate of tumor sphere formation of OVCAR-3 cells.*P＜0.05 vs control siRNA transfected OVCAR-3 cells;#P＜0.05 vs 5.0 μmol·L-1 chrysin treated control siRNA transfected OVCAR-3 cells |
致炎因子TGF-β和TNF-α诱导肿瘤细胞上皮间充质转化表型，从而赋予肿瘤干细胞功能和特性[4]。比较肿瘤球形成率大小是评价肿瘤细胞干细胞特性的一个重要指标，肿瘤球形成作用提高表示细胞的自我更新能力增强。本文采用TNF-α联合慢性暴露TGF-β方案处理卵巢癌OVCAR-3细胞，球形成率测定结果说明TGF-β(5.0 μg·L-1)联合慢性暴露TNF-α(10 μg·L-1)处理能有效地增强卵巢癌OVCAR-3细胞系细胞自我更新能力。结果显示，致炎因子促成OVCAR-3细胞系卵巢癌干样细胞表型。
卵巢癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，手术治疗、放化疗是目前治疗卵巢癌的主要方法。目前，治疗卵巢癌的有效方案以铂类为基础的化疗方案为主，但是其不良反应大，影响患者治疗效果[13]。近年来，白杨素的抗肿瘤作用越来越受到人们关注，许多研究表明白杨素具有预防和治疗肿瘤作用[7-10]。本研究发现白杨素以剂量依赖方式抑制TNF-α联合慢性暴露TGF-β诱导OVCAR-3细胞系球形成并下调NF-κB(p65)蛋白表达，这些结果说明，白杨素具有抑制致炎因子诱导卵巢癌干样细胞自我更新作用。
NF-κB(p65)在细胞生长分化与凋亡、炎症反应以及肿瘤发生等生物学过程中具有重要作用，它一直是人们关注的药物作用靶点[14-16]。Li等[11]研究报道，TNF-α诱导TGF-β慢性暴露人乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞Twist1表达需要NF-κB(p65)，表明这个过程涉及激活经典NF-κB信号传导途径。本文结果也证实TNF-α联合慢性暴露TGF-β诱导上调OVCAR-3细胞NF-κB(p65)蛋白表达。为了探索NF-κB(p65)蛋白表达是否参与白杨素抑制致炎因子诱导卵巢癌OVCAR-3细胞系细胞自我更新作用，我们利用NF-κB(p65) siRNA转染技术初步探讨了白杨素逆转慢性暴露TGF-β联合TNF-α诱导卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成的作用机制。结果显示，NF-κB(p65) siRNA转染协作白杨素抑制致炎因子诱导卵巢癌OVCAR-3细胞系细胞自我更新作用，提示联合其他相关药物可增强白杨素的抑制作用。这些结果为应用白杨素干预致炎因子诱导OVCAR-3卵巢癌干样细胞表型提供了证据，并阐释了抑制炎症与肿瘤联系的关键性转录因子NF-κB活性为白杨素的作用机制之一。
( 致谢: 本研究在湖南师范大学药物工程重点实验室完成，感谢所有给予帮助的老师和同学。 )
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