2. 心肌电生理教育部重点实验室，四川 泸州 646000
2. Key Laboratory on Cardiac Electrophysiology of Education Ministry, Luzho Sichuan 646000，China
动脉硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)是全球发病率和死亡率的主要原因，主要是由动脉粥样硬化导致。目前认为动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，包括内皮功能的紊乱、炎症细胞的募集、细胞因子产生以及血管壁的脂质沉积[1]。既往研究认为，动脉硬化与血脂紊乱有关，然而最近研究发现，血脂正常的自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、肠道炎症性疾病等)患者有严重的动脉粥样硬化，提示慢性炎症在动脉硬化过程中起重要作用[2-4]。
低密度脂蛋白受体(LDLr)是结合血浆来源LDL胆固醇和调节血浆胆固醇水平的主要受体，LDLr活性受细胞内胆固醇浓度的负反馈系统的严密调控[5]。该系统通过调控LDLr 介导的 LDL 摄入以及新生胆固醇合成，确保肝细胞和其他细胞内胆固醇水平稳定。因此，传统观念认为LDLr不参与细胞内胆固醇聚集以及泡沫细胞形成[6-7]。我们前期研究证实，炎症因子如脂多糖(LPS)可通过干扰巨噬细胞上LDLr负反馈调节，上调固醇调节元件结合蛋白-2(SREBP-2)及SREBP裂解激活蛋白(SCAP)的表达，天然LDL通过LDLr被巨噬细胞大量摄入，导致泡沫细胞形成。
雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是哺乳动物细胞合成的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR有2种细胞复合物形式，mTORC1和mTORC2，目前大多数研究都集中在mTORC1，雷帕霉素是其特异性抑制剂。近来研究发现，mTOR信号通路与SCAP/SREBP2复合物及胆固醇调控有密切联系。 但目前关于炎症应激下mTOR通路与细胞内胆固醇失稳态的关系尚不清楚。本研究探讨LPS诱导的炎症应激是否通过激活mTOR通路，增加SCAP/SREBP2表达，干扰SCAP/SREBP2负反馈调控，增加THP-1巨噬细胞对非修饰低密度脂蛋白胆固醇(LDL)摄取，导致泡沫细胞形成。
1 材料人单核细胞株(THP-1)，由重庆医科大学脂质研究中心提供；细胞生长培养基RPMI 1640培养基、胎牛血清(FCS)购于Hyclone公司；低密度脂蛋白(LDL)购于广州奕源生物有限公司；青霉素、链霉素、小牛血清白蛋白(BSA)、佛波醇酯(PMA)、LPS、二甲基亚砜、四乙酸乙二胺(EDTA)、叔丁基对甲酚(BHT)、雷帕霉素(rapamycin)均购于Sigma；4%多聚甲醛、油红O、苏木精均购于北京索莱宝科技有限公司；总RNA提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司;逆转录试剂盒购于日本Toyobo公司；SYBR Green I PCR Mix购于日本TaKaRa公司；8联光学反应PCR管及光学盖子购于美国Bio-Rad公司；细胞蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物技术公司；Bradford试剂购于北京百泰克生物科技有限公司；Anti-LDLr一抗、Anti-S6K1一抗、Anti-mTOR一抗购于美国ABI；鼠抗人Golgi一抗、羊抗兔Fluor(green)488 for SCAP 二抗、羊抗鼠Fluor(Red)594 for Golgi 二抗均购于Molecular Probes。
2 方法 2.1 细胞培养及分组THP-1细胞用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。加佛波醇酯(160 μmol·L-1)于培养液，72 h后待悬浮细胞分化为贴壁生长的巨噬细胞后，用PBS清洗3次，换含抗氧化剂EDTA和BHT无血清培养基培养4 h，将细胞分为3组：① 对照组(5 mg·L-1 LDL)；② 炎症刺激组(5 mg·L-1 LDL+200 μg·L-1 LPS)；③ 炎症+雷帕霉素组(5 mg·L-1 LDL+200 μg·L-1 LPS+10 μg·L-1 Rapamycin)。以上各组细胞培养24 h后收获。
2.2 泡沫细胞鉴定待悬浮细胞分化为贴壁生长的巨噬细胞后，用PBS清洗3次，换含0.2% BSA无血清培养基培养4 h，用冷PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，油红O染色液染色20 min，苏木精复染10 s，自来水冲洗5 min，显微镜下观察并照相。
2.3 总RNA提取和Real-timePCR 根据试剂盒操作说明提取THP-1巨噬细胞总RNA，反转录为cDNA；cDNA合成后，用SYBR GReen I PCR Master Mix进行荧光定量PCR反应，反应参数：50℃ 2 min，95℃ 5 min，然后40个循环(95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 45 s)，72℃10 min 后终止。计算公式如下：实验组相对于对照组基因表达水平的倍数=-exp(△△CT)，其中△△CT=实验组△CT-对照组△CT，△CT=靶基因CT值-β-actin CT值。引物序列：LDLr上游5′-GATAC CAAGGGCGTGAAGAG-3′，下游 5′-CACCAGCGAGTAGATGTCCA-3′；SREBP2上游5′-CCGCCTGTTCCGATGTACAC-3′,下游 5′-TGCACATTCAGCCAGGTTCA-3′;SCAP 上游 5′-TCTGACCGCAAACAAGGAG-3′,下游 5′-CCAGGGAAACACTGAGGACT-3′；mTOR上游 5′-GCCCTCACCTCACAAGACAT-3′，下游5′-GCTCTCTACCCAGCAGAAC-3′；β-actin 上游 5′-CCTGGCACCCACGCACAAT-3′，下游5′-GCCGATCCACACACGGAGTACT-3′。所有引物由上海生物工程技术有限公司设计。
2.4 Westernblot检测蛋白表达 收获细胞，用试剂盒提取蛋白后，定量总蛋白和胞核蛋白浓度，电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温下封闭，用相应的一抗4℃孵育过夜，洗涤后换HRP标记二抗室温孵育1 h；最后ECL化学发光试剂A液、B液按1 ∶1混匀，均匀加至膜上，放入成像仪中采集图像，用Quantity One软件分析条带灰度值。
2.5 激光共聚焦扫描检测SCAP定位THP-1巨噬细胞经实验处理后培养于24孔板中，经PBS洗涤后，用5%福尔马林生理盐水室温下固定30 min；0.25% TritonX-100处理细胞15 min;1% BSA室温下封闭20 min;加入兔抗人SCAP 一抗(终浓度1 ∶100)和鼠抗人Golgi抗体(终浓度1 ∶100)，200 μL每孔，4℃过夜;PBST洗涤后加入羊抗兔Fluor488 for SCAP 二抗(终浓度1 ∶100)，室温下孵育1h;经PBST洗涤后，在激光共聚焦显微镜下观察并采集图片。
2.6 统计学分析数据用x±s表示。由SPSS 20.0统计软件处理，采用F检验比较组间差异。
3 结果 3.1 不同干预条件对巨噬细胞内脂质沉积的影响油红O染色初步证实，与对照组比较，炎症刺激组可见明显的脂质沉积。加入雷帕霉素则抑制了细胞内脂质的沉积，见Fig 1。
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| Fig 1 Morphological examination of macrophages with Oil Red O staining(×200) A:Control；B:LDL+LPS；C:LDL+LPS+Rapamycin |
mRNA水平的影响 如Fig 2所示,与对照组比较，200 μg·L-1 LPS上调了LDLr、SREBP2和SCAP mRNA水平。加入10 μg·L-1 Rapamycin后，LDLr、SREBP2和SCAP mRNA水平被明显抑制。
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| Fig 2 Effect of different conditions on LDLr, SREBP2 and SCAP mRNA levels in macrophages *P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS alone |
mRNA水平的影响 200 μg·L-1 LPS上调了S6K1和mTOR mRNA水平。而加入10 μg·L-1 Rapamycin后，则可明显抑制S6K1和mTOR mRNA水平。见Fig 3。
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| Fig 3 Effect of different conditions on S6K1 and mTOR mRNA levels in macrophages *P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS alone |
当有200 μg·L-1 LPS存在时，上调了LDLr蛋白表达。而加入10 μg·L-1 Rapamycin后，则可明显抑制LDLr蛋白表达。见Fig 4。
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| Fig 4 Effect of different conditions on LDLr protein expression in macrophages *P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS alone |
当有200 μg·L-1 LPS存在时，上调了S6K1蛋白表达。而加入10 μg·L-1 Rapamycin后，则可明显抑制S6K1蛋白表达。见Fig 5。
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| Fig 5 Effect of different conditions on S6K1 protein expression in macrophages *P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS alone |
如Fig 6所示，当有200 μg·L-1 LPS存在时，上调了mTOR蛋白表达。而加入10 μg·L-1 Rapamycin后，则可明显抑制mTOR蛋白表达。
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| Fig 6 Effect of different conditions on mTOR protein expression in macrophages *P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS alone |
用无血清培养基培养巨噬细胞4 h后，分别加入5 mg·L-1 LDL、5 mg·L-1 LDL+200 μg·L-1 LPS、5 mg·L-1 LDL+200 μg·L-1 LPS+10 μg·L-1 Rapamycin处理24 h。用抗人的SCAP抗体和抗高尔基抗体双重染色，在激光共聚焦显微镜下观察(×1 000)。SCAP用绿色表示，高尔基体用红色表示，SCAP和高尔基体的共定位用黄色表示。结果显示，单独加入200 μg·L-1 LPS时，SCAP从内质网到高尔基体的转位异常增加；加入10 μg·L-1 Rapamycin后，明显抑制SCAP从内质网到高尔基体的转位，见Fig 7。
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| Fig 7 Effect of different conditions on translocation of SCAP-SREBP2 complex from endoplasmic reticulum to the Golgi A: Control; B: LDL+LPS; C: LDL+LPS+Rapamycin |
mTOR是哺乳动物细胞合成的一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，有2种细胞复合物形式，mTORC1和mTORC2。目前大多数研究都集中在mTORC1，雷帕霉素是其特异性抑制剂。激活的mTOR 发挥两个方面的功能：一方面，磷酸化其下游区的效应子核糖体蛋白S6 激酶1(S6K1)和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(4EBP1)，从而启动翻译过程，促进细胞生长。第二，生理条件下，S6K1 和4EBP1 与真核细胞启动因子3(elF3)结合，处于无活性状态；在过度生长、炎症、应激等病理条件下，mTOR 与elF3 结合并磷酸化S6K1 和4EBP1，结果是S6K1 和4EBP1 活化，促进了翻译启动和细胞的生长[8]。因此，mTOR 在控制细胞生长及代谢方面起到中心作用。
LPS是一种常用炎症刺激物，通过作用于Toll样受体4(TLR-4)通路,进而激活转录因子-核因子κB(NF-κB)，其最终生物学效应是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)合成分泌增加，导致炎症应激状态，故常用于细胞实验[9]。
近来研究发现，mTOR信号通路与SCAP/SREBP2复合物及胆固醇调控有密切联系[10]。研究发现，mTOR的上游调控蛋白之一，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的特异性抑制剂LY294002可以明显抑制细胞内低胆固醇水平调控的SREBP2从内质网到高尔基体转位，使细胞内胆固醇持续处于低水平；同时，负性表达蛋白激酶B(DN-Akt)质粒转染的CHO细胞内胆固醇也是降低的，激光共聚焦也发现SCAP/SREBP2从内质网到高尔基体转位减少。Porstmann等[11-13]也发现mTOR特异性抑制剂雷帕霉素可以明显抑制SREBP2表达，导致细胞内胆固醇合成减少，细胞生长缓慢。
本实验发现，与对照组比较，LPS明显增加THP-1巨噬细胞组内脂质沉积，雷帕霉素则抑制了炎症组细胞内脂质的沉积(油红O染色证实)。Real-time PCR和Western blot检测发现，炎症LPS应激明显上调THP-1巨噬细胞LDLr mRNA水平和蛋白表达，促进巨噬细胞摄入胆固醇及细胞内胆固醇合成。进一步研究发现，炎症应激上调了细胞内胆固醇敏感期SCAP及其伴随蛋白SREBP2 mRNA水平，这2个蛋白是LDLr的上游调节基因，雷帕霉素抑制SCAP/SREBP2的表达，减少SCAP/SREBP2从内质网到高尔基体的转位，继而减少LDLr表达。我们检测mTOR和其下游调节因子S6K1的mRNA和蛋白表达，结果发现，炎症应激上调THP-1巨噬细胞mTOR和S6K1的mRNA和蛋白表达，提示mTOR信号通路被激活。雷帕霉素明显抑制mTOR和S6K1的mRNA和蛋白表达，继而减少SCAP/SREBP2/LDLr表达及SCAP/SREBP2转位，抑制细胞内脂质堆积，进一步证实炎症应激下THP-1巨噬细胞mTOR通路激活与细胞内脂质超载及泡沫细胞形成有关。
我们的实验数据提示，炎症应激可能是动脉粥样硬化的始动因子，在低血脂水平条件下，炎症应激同样可以促进脂质在巨噬细胞内聚积，导致巨噬细胞泡沫化。本实验给予细胞一个低水平的LDL浓度负荷，在炎症应激下却依然造成细胞内大量脂质聚集，这样或许能解释临床上有不少患者血脂正常甚至偏低，仍然有较高的动脉粥样硬化发生率，部分原因可能与炎症应激诱导脂质由血液向组织细胞分布有关[14]。
综上所述，在THP-1巨噬细胞，炎症应激通过激活mTOR通路，上调SCAP/SREBP2表达，致SCAP/SREBP2异常转位至高尔基体，上调 LDLr表达，导致细胞内胆固醇聚积，泡沫细胞形成，而雷帕霉素能够逆转炎症应激诱导mTOR通路激活，减少细胞内胆固醇沉积，提示炎症应激状态下mTOR可能是泡沫细胞形成的关键通路。
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