HCC)是由于肝纤维化和炎症引起的[1]。肝星状细胞可被肝损伤等激活为肌成纤维细胞样表型，活化的肝星状细胞可参与肿瘤微环境的形成[2]；肿瘤血管生成与肿瘤微环境的形成有密切关系[3]。先前的研究证明，8-溴-7-甲氧基白杨素(8-bromo-7-methoxychrysin,BrMC)具有靶向抑制肝癌干细胞作用[4-5]。本文旨在研究BrMC是否可以抑制肝癌相关星状细胞诱导内皮细胞管结构形成，并探讨其作用机制是否涉及抑制信号转导子和转录激活子-3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT3)激活。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂BrMC 根据文献[6]合成，用二甲基亚砜(DMSO)稀释，母液浓度为10 mmol·L-1；鼠抗人α-肌动蛋白(α-SMA) -Cy3单克隆抗体购于美国Sigma-Aldrich 公司；兔抗人成纤维细胞激活蛋白-α(FAP-α)、p-STAT3和STAT3多克隆抗体均购于美国Abcam公司。
1.2 细胞与成球培养人肝星状细胞系(LX-2)购于上海博谷生物技术有限公司，人肝癌SMMC-7721细胞系和人脐静脉内皮HUVEC-12细胞系购于中国上海科学院细胞库。3种细胞系均用含胎牛血清和青、链霉素的DMEM高糖培养基于培养箱内常规培养。取对数生长期细胞用于实验。参照文献[5]的方法进行成球培养，取第3代球形成细胞用于后续实验。
1.3 条件培养基的获取取第3代干样细胞，用BrMC(0.0、5.0、10.0、20.0 μmol·L-1)处理24 h，参照文献[7]方法，获得SMMC-7721肝癌干样细胞条件培养基(LCSLC-CM)。取LX-2细胞，用LCSLC-CM处理24 h后，采用同样的方法获得肝癌相关星状细胞条件培养基(LCAHSC-CM)。
1.4 免疫荧光和免疫印迹实验取LX-2及肝癌相关星状细胞，按文献[8]方法进行免疫荧光实验，检测α-SMA和FAP-α表达；提取各组细胞总蛋白，按文献[5]方法，采用抗α-SMA、FAP-α、p-STAT3和STAT3抗体进行免疫印迹分析，以β-actin为内参进行灰度分析。
1.5 内皮管结构形成试验采用LCAHSC-CM进行内皮管结构形成试验。操作步骤参照文献[9]方法进行。管结构形成效率按照以下公式计算：管结构形成率/%=各相应处理组管结构均数/完全培养基处理组管结构均数×100%。
1.6 统计学分析采用Spss 15.0进行统计学分析，数据用x±s表示。采用One-Way ANOVA方差分析；首先进行方差齐性检验，在方差齐性时，多组均数比较采用LSD法；在方差不齐时，多组均数间比较采用Tukey’s检验。
2 结果 2.1 肝癌相关星状细胞的鉴定体外单层贴壁生长的肝星状细胞呈星形或梭型，表达α-SMA，弱表达FAP-α蛋白；LCSLC-CM处理的肝星状细胞(肝癌相关星状细胞)伪足增加，表达α-SMA，但FAP-α蛋白表达明显增加。免疫印迹也得到了相似的结果(P＜0.05)。
2.2 BrMC抑制LCAHSC-CM诱导的人脐静脉内皮HUVEC-12细胞管结构形成LCAHSC-CM 孵育人脐静脉内皮HUVEC-12细胞，其内皮管结构明显多于肝星状细胞条件培养基对照组。BrMC处理后，LCAHSC-CM对血管形成的促进作用明显减弱，并且呈剂量依赖关系。结果差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.3 BrMC抑制肝癌相关星状细胞STAT3蛋白磷酸化结果显示，与未处理的体外单侧贴壁生长肝星状细胞相比，LCSLC-CM处理的肝星状细胞STAT3磷酸化蛋白高表达，BrMC处理降低STAT3磷酸化水平，呈剂量依赖性。结果差异有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨论肝星状细胞在肝损伤中被激活转化为肌成纤维样细胞。活化的肝星状细胞及其周围纤维化微环境可产生促进HCC进程作用[2]。另外大量研究证明肝癌干细胞是HCC复发和转移的关键因素[10]。我们的研究发现[7]，LCSLC-CM处理的肝星状细胞高表达FAP-α和α-SMA，说明SMMC-7721源性肝癌干样细胞可以激活肝星状细胞，使之呈肝癌相关成纤维细胞表型。
肿瘤血管生成对HCC发展进程起重要作用。Qu等[11]证明肝癌细胞和肝星状细胞相互作用可以诱导肝癌血管生成。本研究中，我们发现LCAHSC-CM可以促进HUVEC-12细胞内皮管结构形成，并且这一作用可被新型白杨素衍生物BrMC剂量依赖性抑制。同时，我们发现BrMC也可以降低肝癌相关星状细胞STAT3磷酸化水平。
总之，我们的研究结果证明，肝癌干样细胞可以活化肝星状细胞，激活的肝星状细胞可以促进肿瘤血管生成；并且这一作用可被BrMC通过抑制STAT3激活而减弱。因此，本研究的数据为BrMC通过抑制肝癌干样细胞与肝星状细胞之间的交互作用，抑制HCC血管生成作用提供了实验证据。
( 致谢: 本研究在湖南师范大学医学院实验中心完成。感谢导师曹建国教授的悉心指导！感谢孙姝雯师姐以及邹辉老师等人的帮助！ )
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