2. 云南省第一人民医院，云南 昆明 650032;
3. 中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223
2. the First People′s Hospital of Province, Kunming,650032,China ;
3. Kunming Institute of Zoology, CAS,Kunming 650223,China
乙型病毒性肝炎是由乙型嗜肝DNA病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的一种世界范围内的传染性疾病，对人类健康危害重大[1]。目前，临床上应用最广泛的抗乙肝病毒药物是拉米夫定(lamivudine,3TC)等核苷类化合物[2]，但长期应用核苷类药物，编码HBV DNA聚合酶/逆转录酶的基因区域会发生点突变而产生病毒耐药株，使得抗病毒效果大为下降[3]。因此，寻找新的抗病毒药物靶点成为乙肝研究中的重点与热点。金丝桃素(hypericin，4,4′,5,5′,7,7′-六羟基-2,2′-二甲基[中位]萘骈二蒽酮)，是贯叶连翘等金丝桃素植物的主要活性成分之一，有强效抗乙肝病毒活性，但与核苷类药物不同，其对HBV DNA聚合酶/逆转录酶无抑制作用，却可以明显下调pgRNA表达水平，提示其药物作用靶点可能与pgRNA相关[4]。本实验对金丝桃素抗乙肝病毒作用进行验证，并在此基础上对金丝桃素的可能靶点pgRNA以及靶点相关调控因子的表达进行了更加深入的研究。
1 材料与方法 1.1 实验材料可分泌HBV活病毒的肝细胞株HepG2.2.15；金丝桃素(95%，HPLC，Sigma)；3TC(GSK)；高糖DMEM 培养液及胎牛血清(Gibco)；胰酶(碧云天)；地高辛标记及检测试剂盒(Roche)；Bio-Rad反转录试剂盒及SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒；AxyPrep液体病毒DNA/RNA提取试剂盒及总RNA小量制备试剂盒；乙型肝炎病毒表面抗原( Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg) 和乙型肝炎病毒e抗原( Hepatitis B virus e antigen，HBeAg)检测试剂盒购自上海科华生物工程公司；实验所用抗体均购自Abcam公司。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养及化合物干预将细胞以1~2×106接种于10 cm培养皿中，所有细胞均使用含有10%小牛血清的培养基培养。细胞培养24 h后，分为3组，金丝桃素以半数有效浓度0.5 μmol·L-1为终浓度加入实验组细胞的培养基中，3TC以半数有效浓度1.0 μmol·L-1为终浓度加入对照组细胞的培养基中，去离子水为空白对照加入空白对照组的细胞的培养基。24 h更换一次培养基，72 h后进行指标检测。
1.2.2 HBV DNA复制水平检测使用AxyPrep液体病毒DNA/RNA小量制备试剂盒提取HepG2.2.15细胞培养基中细胞分泌的HBV DNA。取各组所提取的DNA样品30 μg，使用Southern blot检测HBV DNA的复制情况，使用地高辛标记试剂盒标记的HBV DNA探针杂交过夜，化学发光显影。取各组DNA样品，使用染料法荧光定量PCR，检测HBV DNA复制水平。
1.2.3 ELISA 检测HBsAg 和HBeAg 的抑制率吸取不同药物处理后的各组细胞上清，用ELISA 法测定细胞上清液中的HBsAg 和HBeAg抗原量。
1.2.4 总RNA的提取与目标mRNA表达水平检测收集各组细胞，使用 AxyPrep总RNA小量制备试剂盒提取细胞中的总RNA。取各组所提取的总RNA 10 μg，Northern blot检测pgRNA表达，地高辛标记试剂盒标记的pgRNA探针杂交，化学发光显影。取各组所提取的总RNA 1 μg进行反转录，以得到cDNA为模板，使用染料法荧光定量PCR检测pgRNA及肝富集因子mRNA的表达水平进行检测，GAPDH为内参，荧光定量PCR引物见Tab 1。
| Target | Forward primer(5′→3′) | Reverse primer(5′→3′) |
| HBV DNA[5] | TCCTCTTCATCCTGCTGCTATG | CGTGCTGGTAGTTGATGTTCCT |
| pgRNA[5] | CTCAATCTCGGGAATCTCAATGT | TGGATAAAACCTAGCAGGCATAAT |
| HNF3β[6] | AGGAGGAAAACGGGAAAGAA | CAACAACAGCAATGGAGGAG |
| HNF4α[7] | AGCTGCAGATCGATGACAATGAG | CATACTGGCGGTCGTTGATGTAG |
| PPARα[8] | CATTACGGAGTCCACGCGT | ACCAGCTTGAGTCGAATCGTT |
| RXRα[9] | ACATTTCCTGCCGCTCGATT | ATGTCCTCGCTGCTGCTGAC |
| GAPDH[7] | GCACCGTCAAGGCTGAGAAC | TGGTGAAGACGCCAGTGGA |
将收集细胞的使用RIPA Lysis Buffer进行重悬(50 mmol·L-1 Tris-HCl(pH 7.4)+150 mmol·L-1 NaCl+1% NP-40+PMSF)，放入液氮中反复冻融2~3次，离心后取上清液。取各组所提取蛋白20 μg，Western blot检测肝富集因子NF3β,HNF4α,PPARα/RXRα的表达水平，β-actin为内参基因，SDS-PAGE胶电泳，pvdf膜印迹，脱脂牛奶封闭后，一抗孵育过夜，二抗孵育2 h，化学发光显影。
1.2.6 统计学分析采用统计软件SPSS13.0进行分析，正态计量数据以x±s表示，正态数据组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。
2 结果 2.1 金丝桃素对HBVDNA复制的影响 对HBV DNA的Southern blot和荧光定量PCR检测表明，与空白对照组相比，金丝桃素组与3TC组的HBV DNA的表达有明显下调(P＜0.05)。
2.2 金丝桃素对HBsAg和HBeAg的抑制率 ELISA法检测各组HBsAg 和HBeAg在药物处理后的表达变化可见，3TC组、金丝桃素组相较于空白对照组，HBsAg 和HBeAg的数量明显下降，抑制率均有升高(P＜0.05)。
2.3 金丝桃素对pgRNA的表达水平的影响Northern blot结果和荧光定量PCR结果均显示金丝桃素组与空白对照组相比，HepG2.2.15 细胞株pgRNA下降明显(P＜0.05)，但3TC组与空白对照组相比，pgRNA表达无明显变化( P>0.05)。
2.4 金丝桃素对肝富集因子的影响为了了解pgRNA表达水平降低的原因，研究分别从mRNA与蛋白质水平初步探查了金丝桃素对调控pgRNA转录的几个相关的肝富集转录因子表达水平的影响。Western blot结果与荧光定量PCR结果都表明，金丝桃素组相比于空白对照组，HepG2.2.15细胞株HNF3β的表达明显升高(P＜0.05)，HNF4α表达降低(P＜0.05)，而PPARα/RXRα的表达没有明显变化(P>0.05)，而拉米夫定组与空白对照组相比，4种调控因子均无明显表达变化(P>0.05)。
3 讨论本研究结果表明，与空白对照组相比，金丝桃素实验组中，HepG2.2.15产生的HBV DNA与HBsAg与HBeAg均有下降，证明金丝桃素具有强效抗乙肝病毒活性，但其作用靶点与核苷类化合物并不相同[4]，其会明显降低pgRNA的表达。而pgRNA不仅是HBsAg与HBeAg的翻译模板，同时也是HBV DNA的反转录模板[10-11]。其表达量下调，不仅可以减少生成核衣壳的核心蛋白的表达，更能直接减少病毒逆转录生成新的HBV DNA，因此金丝桃素的作用靶点很可能与pgRNA相关。pgRNA的下游产物HBs和HBe对pgRNA的生成不具有调节作用[12]。pgRNA的表达由上游的肝富集调控因子调控，HNF3β对HBV的复制有抑制作用，HNF4α和PPARα/RXRα对HBV的复制起正向调控的作用[13-15]。为了进一步探究金丝桃素如何作用于pgRNA，实验在药物干预后，检测了HepG2.2.15细胞中的4种调控因子表达水平。结果显示，金丝桃素在肝脏细胞中能使pgRNA表达下调的肝富集因子HNF3β蛋白表达水平升高，使pgRNA表达上调的HNF4α蛋白表达水平下降。而另外两种调控因子PPARα/RXRα表达无变化。这说明金丝桃素有可能作用于调控pgRNA转录的肝富集因子HNF3β、HNF4α，使其表达水平发生变化，从而使pgRNA的表达降低。
( 致谢: 本实验在华中科技大学同济医学院肝病研究所完成，在此深表感谢！ )
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