特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病，伴随着皮肤瘙痒，易复发，并且影响着各个年龄段的人群。AD患者有较高的患严重的过敏性疾病、精神疾病以及皮肤感染[1]几率。治疗AD的重点在于恢复和维持皮肤屏障功能、减轻炎症，以及对过敏性疾病关键启动因子和通路进行抑制。研究AD的发病机制和防治措施是当前皮肤病研究领域的热点之一。
建立理想的AD动物模型是研究AD的基础，现在小鼠AD模型的主要制作方法有卵蛋白(OVA)诱导的皮肤主动过敏反应[2]、二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠耳部三相皮肤反应[3]、异硫氰酸荧光素(FITC)等半抗原重复刺激诱导的皮肤反应[4]以及通过转基因和基因敲除产生的特应性皮炎小鼠模型。卡泊三醇(MC903)是一种人工合成维生素D3的类似物，广泛用于治疗银屑病[5]，并且能够抑制白血病细胞的增殖分化[6]。近年来，有研究表明，局部应用MC903能引起小鼠特应性皮炎综合征，同时MC903能够通过上皮角质形成细胞维生素D受体(VDR)引起胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的高表达[4]。TSLP是一种上皮细胞来源的细胞因子，在起始和促进Th2细胞介导的过敏性炎症中起关键作用[8]。因此，基于TSLP研究特应性皮炎具有重要的意义。但模型建立的条件文献报道差异较大，MC903的剂量及随着时间模型中关键细胞因子及效应细胞的变化趋势不明确，因此，本研究通过探索MC903诱导的TSLP高表达的小鼠特应性皮炎模型的最适条件，为研究过敏性疾病的发病机制以及治疗措施提供帮助。
1 材料和方法 1.1 仪器测厚规，日本Mitutoyo公司，型号：7301；电子天平，瑞典Mettler-Toledo公司，型号：PL203；酶标仪，美国Bio-Tek公司，型号：SyneRgy 2；冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司，型号：GS-15R；流式细胞仪，美国BD公司，型号：Accuri C6。
1.2 实验动物BALB/c小鼠，♂，SPF级，体质量18~22 g，SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号码：SCXK(京)2012-0001。饲养于南京中医药大学动物实验中心SPF级环境中，环境温度为22℃～25℃，湿度为50%～65%，实验前动物均进行1周适应性饲养。
1.3 主要试剂卡泊三醇(MC903)，Tocris，批号：112965-21-6；小鼠TSLP ELISA试剂盒，eBioscience，批号：E09338-1631；小鼠IL-33 ELISA试剂盒，eBioscience，批号：E11107-1643；小鼠 IL-4 ELISA试剂盒，eBioscience，批号：E09338-1631；小鼠 IFN-γ ELISA试剂盒，eBioscience，批号：E09342-1631；PE-抗小鼠CD40抗体,eBioscience，批号：E028955；APC-抗小鼠CD86抗体，eBioscience，批号：E028452；FITC-抗小鼠Lineage cocktail抗体，BioLegend，批号：B174972；PE-抗小鼠CD25抗体eBioscience，批号：E01153-1633；APC-抗小鼠ST2/IL33R抗体，eBioscience批号：E19489-80；总蛋白定量试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20131212。
1.4 动物分组及处理 1.4.1 MC903诱导的小鼠特应性皮炎剂量探索实验BALB/c小鼠按体质量分层法随机分成4组，每组12只：包括1个空白组，3个剂量组(0.33、1、3 nmol·ear-1 )，MC903溶于体积分数为0.95的乙醇涂布于每个小鼠右耳，左耳涂等剂量乙醇溶剂，每耳涂布体积为20 μL[9]。从d 0起每天连续处理至d 6。每天测量小鼠的耳厚(d 0给药前测耳厚)，分别于d 3、d 7每组取6只小鼠的耳组织进行匀浆制备。
1.4.2 MC903诱导的小鼠特应性皮炎时间探索实验BALB/c小鼠按体重分层法随机分成6组，每组7只，包括：1个空白组、5个剂量组(分别诱导1、3、7、11、15 d)。2 nmol MC903溶于体积分数为0.95的乙醇涂布于每个小鼠右耳，左耳涂等剂量乙醇溶剂，每耳涂布体积为20 μL[9]。每天测量小鼠的耳厚(d 0给药前测耳厚)，分别于d 1、3、7、11、15取小鼠的耳组织和颈部淋巴结，分别进行匀浆制备、病理组织学检查及流式细胞仪分析。
1.5 小鼠耳肿胀度检测及耳组织病理学检查每天测定小鼠两耳厚度，计算耳肿胀度(右耳厚度-左耳厚度)，并于取材时测定小鼠两耳重量差值(右耳重量-左耳重量)。取小鼠耳廓固定后，从耳根至耳尖切开，取半只耳廓，垂直于切面石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜下在耳廓全长的中点左右各取同倍率视野拍照。
1.6 耳匀浆的制备与细胞因子表达水平的检测将小鼠用直径8 mm的皮肤圆形打孔器摘取右耳耳片标本，称重，用PBS溶液研磨成2.5%的耳组织匀浆，静置后，放置于4℃离心机进行4 000 r·min-1的转速低温离心15 min，获得标本上清液。采用ELISA技术检测匀浆中细胞因子IL-4、IFN-γ、TSLP、IL-33的表达水平，并用蛋白含量BCA法检测样本总蛋白水平后进行蛋白矫正，炎性细胞因子的表达水平表示为μg·g-1 Pro。
1.7 流式检测Ⅱ型固有淋巴细胞(ILC2s)及树突状细胞(DCs)表面标记分子CD40+、CD86+在淋巴细胞内的百分含量小鼠取材时分离颈部皮肤，收集颈部淋巴结，用机械研磨法在生理盐水中制备单细胞悬液，经200目滤布过滤后，调整细胞密度为每毫升12×107个 。ILC2s细胞的检测：取上述制备得的细胞悬液100μL于离心管中，分别加入0.2 μg CD25抗体、0.2 μg IL-33R/ST2抗体、Lineage cocktail抗体(每管20 μL)避光孵育15 min,经生理盐水充分洗涤后(每次1 mL，共2次)，用500 μL生理盐水重悬，流式细胞仪检测。DCs表面标记分子CD40+、CD86+的检测：取100 μL细胞悬液，分别加入0.2 μg CD40抗体及0.2 μg CD86抗体，避光孵育15 min，经生理盐水充分洗涤后(每次1 mL，共2次)，用500 μL生理盐水重悬，流式细胞仪检测活化的DC细胞(CD40+CD86+)和ILC2细胞(Lin-CD25+ST2+)的百分含量。
1.8 统计学方法数据以x±s表示，应用GraphPad Prism 5.0统计软件，两组组间比较采用student t-test检验，多组间比较采用One-way Anova (Dunnet’t)。
2 结果 2.1 MC903诱导特应性皮炎剂量探索实验 2.1.1 小鼠耳肿胀度检测从d 0起，小鼠右耳分别涂布0.33、1、3 nmol MC903，连续诱导7 d。结果表明，与对照组比较，各模型组耳厚差随MC903诱导剂量和天数的增加而增加(Fig 1A)，MC903诱导3 d后，3 nmol剂量组耳重有明显增加(Fig 1B)，攻击7 d后，1、3 nmol剂量组耳重均明显增加(Fig 1C)。
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| Fig 1 Effects of different doses of MC903 on ear thickness difference and ear weight difference of mice after induced for 3 days(B) and 7 days(C) (x±s,n=6),**P＜0.01 vs control |
从d 0起，小鼠右耳分别涂布每耳0.33、1、3 nmol MC903，每耳连续诱导7 d。ELISA法测定耳匀浆上清液中过敏性疾病关键启动因子TSLP、IL-33及炎症因子IL-4的表达。结果表明：d 3和d 7 1、3 nmol剂量组TSLP水平与空白组相比均升高，而d 3 3 nmol组表达最高,d 7 1 nmol组表达最高(Fig 2A)。MC903攻击3 d后各剂量组IL-33表达水平与空白相比差异均无显著性，攻击7 d后3 nmol组与空白相比有明显增加(Fig 2B)。3 nmol组耳组织匀浆中Ⅱ型炎症因子IL-4在d 3、d 7的表达水平与空白组相比均增加(Fig 2C)。
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| Fig 2 Effect of different doses of MC903 on cytokine levels in ear homogenate of mice after induced for 3 days and 7 days (x±s,n6);**P＜0.01 vs control |
上述结果表明，1 nmol和3 nmol剂量在d 7均能引起小鼠特应性皮炎，但1 nmol时未能引起IL-4的明显升高。3 nmol MC903·ear-1 剂量在d 3时已经引起小鼠耳重及耳厚差以及IL-4的明显升高，但过早的诱导耳部炎症反应不利于我们观察特应性皮炎诱导初期关键启动因子TSLP和IL-33的变化。因此，我们选择介于二者之间的2 nmol MC903·ear-1 剂量进一步作给药时间探索。
2.2 MC903诱导特应性皮炎给药时间探索 2.2.1 小鼠耳肿胀度检测MC903以2 nmol·ear-1 剂量诱导后，耳厚差随给药天数的增加而增加，并于d 14达到峰值，d 7、d 11、d 15耳重差与空白组相比均增加(Fig 3A、B)。
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| Fig 3 Effect of 2 nmol MC903 per ear on ear swelling and histopathology of mice(x±s,n=7,magnification×200) The sharp-outlined ear tissue of control group has no inflammatory cell infiltration and swelling. The ear tissue of mice induced by MC903 for 7 days and 15 days has apparently swelling and inflammatory cell infiltration,along with obvious hemangiectasis.**P＜0.01 vs control |
HE检查表明空白组小鼠的耳组织轮廓清晰，未见炎症细胞浸润、水肿增厚和血管充血等病理改变现象，而MC903 2 nmol·ear-1 诱导7 d和15 d的小鼠耳组织水肿明显增厚，出现大量炎性细胞浸润，并且有明显的血管扩张现象(Fig 3C)。
2.2.3 耳匀浆中炎性细胞因子的表达从d 0起，以2 nmol·ear-1 连续诱导至d 14。d 3、d 7 TSLP表达水平与空白组相比有明显增加，并且在d 3达到最高(Fig 4A)。d 7、d 11、d 15 IL-33、IL-4表达水平与空白组相比明显升高，并且于d 7达到最高(Fig 4B、C)。d 7 IFN-γ的表达水平与空白组相比有明显升高(Fig 4D)。
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| Fig 4 Effect of 2 nmol MC903 per ear on cytokine in ear tissue homogenate of mice at different time points(x±s,n=7),**P＜0.01 vs control |
采用流式细胞仪技术检测外淋巴结中DCs活化的共刺激分子CD40、CD86和ILC2s的百分含量。结果显示，与空白组相比，小鼠淋巴结组织的CD40+CD86+和ILC2s含量在d 7和d 15均有升高，其中d 7的CD40+CD86+细胞和d 15的CD40+CD86+细胞及ILC2s含量与空白组相比差异均有统计学意义(Fig 5A、B)。
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| Fig 5 Effects of 2nmol MC903 per ear on DCs surface markers CD40+CD86+ and ILC2s contents in lymph nodes of mice after induced for 7 days and 15 days(x±s,n=7)**P＜0.01 vscontrol |
特应性皮炎也称为特应性湿疹，往往伴随着强烈的瘙痒和湿疹的病变，是常见的慢性疾病。多年来,它被认为是过敏性疾病的最初反应,最终会导致哮喘和过敏性鼻炎[1]，因此,研究特应性皮炎的发病机制，对预防和治疗具有重要的意义。为了深入研究特应性皮炎的发病机制，国内外学者尝试多种方法来建立特应性皮炎动物模型。TSLP是一种上皮细胞来源的细胞因子，在起始和促进Th2细胞介导的过敏性炎症中起关键作用[10]；IL-33属于IL-1家族，通过受体ST2活化Th2细胞[11]。本研究基于TSLP和IL-33建立特应性皮炎动物模型，期望能够为过敏性疾病启动阶段的研究提供一种可靠的模型。
MC903是维生素D3的低钙类似物，能激发小鼠上皮角质细胞高表达TSLP，TSLP通过与DC上的TSLP受体结合，从而诱导DC活化，促进CD4+T细胞向Th2细胞分化[12],CD40和CD86是DC表面的共刺激分子，它们的表达高低与DC细胞的成熟度呈正相关。IL-33能够促进ILC2s细胞聚集和活化，升高Th2型的细胞因子的释放[13]。能够引起小鼠特应性皮炎综合征。目前文献报道中关于MC903的诱导 天数和剂量均有较大差异，因此建立稳定的诱导剂量和天数的模型具有重要意义。本研究采用BALB/c小鼠，分别对MC903诱导天数和剂量进行探索。在给药剂量探索实验中，3 nmol MC903·ear-1 剂量诱导7 d后TSLP、IL-33、IL-4均有明显升高，1 nmol MC903·ear-1 诱导7 d后TSLP、IL-4显著升高，两个剂量组耳肿胀度均明显增加。综合考虑特应性皮炎启动因子、炎症因子以及耳肿胀度的变化，本研究选取2 nmol MC903·ear-1 剂量的剂量进一步做诱导天数探索实验，结果表明2 nmol MC903·ear-1 诱导7 d后小鼠右耳耳肿胀明显，耳组织红肿，毛细血管扩张，炎性细胞浸润明显。TSLP在d 3明显升高，随后逐渐降低； IL-33以及IL-4在d 7明显升高，随后逐渐降低。 TSLP主要通过与DC上的TSLP受体结合从而诱导DC活化，促进CD4+T细胞向Th2细胞分化[12]。IL-33能够促进ILC2s细胞聚集和活化，ILC2s细胞是免疫应答初期分泌Th2型的细胞因子的主要来源，最终升高Th2型的细胞因子的释放[13]。因此DC和ILC2分别在TSLP和IL-33的作用下活化，继而产生Th2型炎症。我们的研究结果表明小鼠淋巴结组织的活化DCs和ILC2s含量在d 7和d 15均有升高，说明在此模型中不仅TSLP、IL-33升高，也表现出其相关效应细胞的明显变化。因此，在2 nmol MC903·ear-1 诱导7 d能够成功建立小鼠特应性皮炎。TSLP较适检测点为d 3，IL-33/IL-4较适检测点为d 7。
综上所述，运用2 nmol MC903·ear-1 诱导小鼠7 d后可以良好的模拟特应性皮炎的症状以及病理变化，尤其是能反映TSLP和IL-33等细胞因子的变化趋势。本模型操作简单，造模成功率高，易于复制，可以成为研究特应性皮炎的重要工具。
( 致谢: 本实验在南京中医药大学药学院、科技部国家规范化中药药理实验室、江苏省中药药效与安全性评价重点实验室完成。 在此感谢实验室为我提供的优越实验条件与平台，同时感谢导师和同学对我的指导和帮助！ )
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中国科协主管,中国药理学会主办
文章信息
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-01
- 修订日期: 2016-03-05