母亲患抑郁症对于子女的生理心理发育有不良影响，尤其是母亲的抑郁发病期在子女婴幼儿早期，神经系统发育的关键期[1]。母亲患抑郁症导致其喂养消极，情感反应冷淡，形成子女早年的不良生活事件或应激，进而影响子女的生长发育水平，并使其更易形成神经精神疾病。Shrivastava等[2]的研究显示，母亲的抑郁症对于儿童的行为异常、自杀观念有重要影响，使儿童成年后更易患抑郁症。Conron等[3]研究也指出，抑郁母亲的子女更易行为异常，更易形成自杀观念，并且抑郁症首次发病年龄更早。抑郁母亲的子女抑郁症的发病率明显增加。
目前常用的抗抑郁药物主要通过增加脑内单胺类如5-羟色胺、去甲肾上腺素的浓度来发挥抗抑郁作用。这些抗抑郁药物多起效缓慢，不良反应多，患者服药依从性较差等。因而对于快速抗抑郁药物的研究成为迫切的临床需求。临床研究结果显示，氯胺酮是一种离子型谷氨酸能(ionotropic glutamatergic n-methyl-d-aspartate，NMDA)受体拮抗剂，能在短时间内明显缓解抑郁症状[4]。进一步分子机制研究表明，蛋白激酶B(protein kinase B,或 Akt)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamcycin,mTOR)参与了氯胺酮的快速抗抑郁过程。氯胺酮激活Akt及mTOR，从而进一步促进神经可塑性变化，因而在动物模型上表现出明显的抗抑郁作用[5]。我们前期的研究结果也显示，越鞠甘麦大枣汤也可快速缓解动物模型的抑郁样行为，与氯胺酮类似[6]。
本实验基于前期夏宝妹等[6]的母代产后抑郁模型，进一步探究母代产后抑郁对子代抑郁症发病的影响，观察越鞠甘麦大枣汤对子代抑郁的作用，并且研究其对于小鼠海马Akt及mTOR表达的影响，试图解释越鞠甘麦大枣汤快速缓解子代抑郁样行为的机制，以期为快速抗抑郁药物的研发提供参考。
1 材料 1.1 实验动物SPF清洁级健康Balb/c成年小鼠，体质量20 g~25 g，购买于军事医学科学院，动物合格证号：SCXK-(军)2012-0004。动物房室温(20~25)℃，湿度40%~70%，昼夜交替时间为12 h，动物可自由饮水进食。
1.2 实验药物实验用中药材购于南京中医药大学国医堂门诊，经本校药学院杨连云教授鉴定，为中国药典收载品种。越鞠甘麦大枣汤由苍术[Atractylodes lancea(Thunb.)DC.产自江苏]100 g、香附(Cyperus rotundus L.产自浙江)100 g、神曲(Massa Medicata Fermentata.产自福建)100 g、栀子(Gardenia jasminoides Ellis.产自湖南)100 g、川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.产自四川)100 g、炙甘草(Glycyrrhizae uralensis Fisch.产自河北)125 g、淮小麦(Triticum aestivum L.产自河南)250 g、大枣(Zizyphus jujube Mill.产自四川)375 g组成，上述药物加八倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h过滤，再加6倍量水按上法煎煮后过滤，合并两次药液，65℃减压旋蒸浓缩，浓缩后的药物终浓度为8.3 g·kg-1。配好的药物分装在10 mL离心管内，-20℃保存。本实验所用中药材由同一人员煎煮，煎煮时间，使用器具及煎煮方法固定，从而形成了固定的药物提取流程。
1.3 实验仪器与试剂RE-852旋转蒸发仪(南京金正教学仪器有限公司)；SB5200-型超声清洗机(上海Branson公司)；Z-32台式离心机(德国Hermle公司)；AE100电子天平(METTLER公司)；蛋白电泳及转膜系统(Bio-Rad)；凝胶成像及分析系统(Tannon)。试剂：RIPA裂解液：Beyotime，货号：P0013B；蛋白酶抑制剂Cocktail：Cell Signaling Technology，货号：#5871S；蛋白Marker：货号：00222891；一抗：均为兔抗小鼠，p-mTOR(Cell Signaling Technology，货号：#2971S，1 ∶500)；mTOR(Cell Signaling Technology，货号：#2983S，1 ∶500)；p-p70S6K(Cell Signaling Technology，货号：#9234S，1 ∶500)；p70S6K(Cell Signaling Technology，货号：#2708S，1 ∶1 000)；p-Akt(Abways，货号：CY6569，1 ∶500)；Akt(proteintech，货号：10176，1 ∶1 000)。β-tubulin (Epitomics，1879-1，1 ∶2 000)； 二抗：中杉金桥羊抗兔，批号：109525；ECL显色液：康为世纪，批号：2514K。
2 方法 2.1 抑郁母代模型的建立抑郁母代动物模型参照夏宝妹等[6]报道孕前应激造模法。具体如下：Balb/c成年♀鼠48只,随机分为2组：对照组(24只)和孕前应激模型组(24只)。对照组不给予任何刺激，孕前应激组给予慢性应激：束缚(每天6 h)联合24 h光照刺激(2次/周)，共刺激3周。应激结束后，与正常♂鼠合笼交配怀孕，并于分娩3周后检测♀鼠行为学，以验证抑郁母代造模成功。
2.2 抑郁子代模型的形成与分组正常母代(CTL)与抑郁(PPD)母代所生的F1(第1代)与母代同笼至3周(断奶)，按♀♂分笼，每笼6~8只。平均每笼选取同一出生时段的♂子代小鼠2只，形成正常子代组(CTL-F1，8只)，产后抑郁子代给予生理盐水组(Veh，8只)及产后抑郁子代给予越鞠甘麦大枣汤组(YG，8只)。
2.3 抑郁子代行为测量与给药Veh组给予生理盐水1次，YG组给予越鞠甘麦大枣汤1次，剂量为8.3 g·kg-1，浓度为10 mL·kg-1。于单次给药24 h后测量强迫游泳实验(forced swimming test，FST)，以观察PPD-F1的抑郁表型以及越鞠甘麦大枣汤对抑郁子代行为的影响。所有动物均为单次给药，由同一人员在同一时间点操作，以减少操作误差。
2.4 小鼠行为学测试(FST)将小鼠分别放入玻璃烧杯中，水温保持在24℃~26℃。让小鼠在其中游泳2 min后，立刻开始观察记录接下来4 min内小鼠总的不动时间：即小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态，仅做微小动作以保持平衡。
2.5 Western blotWestern blot法检测Akt及m-TOR的磷酸化及总体水平。提取小鼠海马蛋白，用Nanodrop测定样品中的蛋白浓度。根据Akt及m-TOR的分子量选择不同浓度的SDS-PAGE胶(Akt：10%胶；m-TOR：8%胶)来分离蛋白质，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，将PVDF膜放入一抗封闭缓冲液中，室温下摇床轻柔震荡1 h，然后分别加入p-Akt、Akt、p-mTOR、m-TOR及β-tubulin的抗体的孵育盒中，摇床上轻摇，4℃过夜。然后用TBST缓冲液漂洗3次，摇床剧烈震荡，每次10 min。将洗涤后的PVDF膜放入加有羊抗兔二抗的抗体孵育盒中，室温下孵育1 h。再于TBST缓冲液中洗涤3次，方法如前。最后用ECL显影液显影，采集p-Akt、Akt、p-mTOR、m-TOR及β-tubulin的条带灰度值，得到各样本蛋白的灰度比值。
2.6 统计学方法所有数据采用SPSS 16.0分析应用软件处理分析，多组数据比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，数据均采用x±s表示。
3 结果 3.1 越鞠甘麦大枣汤对抑郁子代强迫游泳行为的影响抑郁子代生理盐水组强迫游泳不动时间明显延长，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)；中药越鞠甘麦大枣汤组的游泳不动时间明显缩短(P＜0.01)，与生理盐水组相比差异有统计学意义(Fig 1)。
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| Fig 1 Immobility time of mice in forced swimming test 24 hours after administration **P＜0.01 vs CTL-F1；##P＜0.01 vs Veh |
相对比对照组，抑郁子代生理盐水组小鼠海马中p-Akt表达明显下调，差异有统计学意义(P＜0.05)；而给中药越鞠甘麦大枣汤后，小鼠海马p-Akt表达明显上调(P＜0.05)，与生理盐水组相比差异有统计学意义(Fig 2)。
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| Fig 2 p-Akt expression at 24h in hippocampus of mice *P＜0.05 vs CTL-F1；#P＜0.05 vs Veh |
抑郁子代生理盐水组小鼠海马中p-mTOR表达与对照组相比明显下调，差异有统计学意义(P＜0.05)；而给中药越鞠甘麦大枣汤后，小鼠海马p-mTOR表达明显上调(P＜0.05)，与生理盐水组相比差异有统计学意义(Fig 3)。
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| Fig 3 p-mTOR expression at 24 h in hippocampus of mice *P＜0.05 vs CTL-F1；#P＜0.05 vs Veh |
母代抑郁对子女产生的不良影响日益受到重视。有研究发现，约70%的母亲抑郁可以持续到子女出生后的前6个月，而这些子女在1周岁时表现出生长发育缓慢[1]。母亲患抑郁症，影响其哺育行为，子女无法得到周全的照顾，这种来自母亲的应激，更易导致子女神经发育迟缓，从而易患神经精神疾病。有研究显示，抑郁母亲的子女相比较正常子女更容易患抑郁症[2, 3, 7]。本研究支持此观点。结果显示：母代抑郁的子代小鼠在强迫游泳上表现出不动时间延长，强迫游泳行为是反映小鼠的绝望行为，是抑郁样行为表现的一个重要方面。
越鞠甘麦大枣汤是由越鞠丸和甘麦大枣汤组合而成。这两者均为中医治疗情志异常的经典名方。周红香等[8]报道合用越鞠丸和甘麦大枣汤加减可有效缓解产后抑郁症患者的症状。另有临床使用越鞠丸加减可治疗卒中后抑郁[9]，而秦竹等[10]研究发现，甘麦大枣汤可缓解慢性不可预知模型下大鼠的抑郁样表型。本研究合用二方，发现其可快速缩短抑郁子代小鼠的强迫游泳的不动时间，在缓解子代抑郁样行为上表现出良好的效果，提示越鞠甘麦大枣汤具有快速抗抑郁潜力。这一结果与我们前期实验结果相同。夏宝妹等[6]发现，越鞠甘麦大枣汤可快速缓解产后抑郁母代小鼠的抑郁样表型，本研究结果发现其亦可逆转抑郁子代的抑郁样行为。
目前临床上常用的抗抑郁药物多为单胺增强类药物，显效时滞长，不利于患者的依从性，增加自杀倾向患者的风险。虽然这些药物可在短时间内迅速增强单胺类，如5-羟色胺、去甲肾上腺素的浓度，但是患者的抑郁症状却不能立即缓解。目前，对于抑郁症的神经可塑性假说得到了更多的支持[11]。该假说认为抑郁症是由情感相关脑区的神经可塑性对诸如应激压力等不良适应造成的。抗抑郁治疗引起神经信号传导和细胞内特定基因及相关的突触可塑性、神经营养因子和海马神经新生等神经系统可塑性的改变，从而成为抗抑郁作用的微观基础。
低剂量的氯胺酮可快速持久缓解抑郁症患者的症状，在动物实验上也显示了其良好的抗抑郁效果。分子机制研究发现，氯胺酮可快速激活Akt和mTOR等[5]，从而促进突触可塑性[12]，与抗抑郁效果密切相关。mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它广泛表达，功能主要受神经元表面受体和离子通道的活性影响，对于诱导和维持神经元长时程增强(long-term potentiation，LTP)和长时程抑制(long-term depression,LTD)有重要影响[13-15]，从而可能参与了记忆以及抑郁症的过程。能影响mTOR表达的离子通道和受体包括NMDA受体以及脑源性神经营养因子(BDNF)等。同时，mTOR又是多种信号通路和受体的下游的交汇点，可受蛋白激酶B，也就是Akt激酶的影响[16]。mTOR通路参与蛋白质转录、翻译、降解和自噬等多种过程，尤其对于突触可塑性具有重要作用[17]。本研究中，越鞠甘麦大枣汤于给药后24 h激活子代小鼠海马Akt和mTOR，使表达上调，这一结果也与夏宝妹等[18]在产后抑郁母代上的观察结果一致，提示了越鞠甘麦大枣汤可能通过激活Akt和mTOR，进一步促进突触可塑性的改变，从而发挥了快速的抗抑郁作用。
本研究观察了越鞠甘麦大枣汤对于产后抑郁子代的影响，并且进一步分析了其内在机制。我们已经观察到越鞠甘麦大枣汤可快速降低产后抑郁子代小鼠的强迫游泳不动时间，并且可上调mTOR和Akt分子的表达，下一步应继续分析其下游分子如S6K等的变化，进一步深入分析越鞠甘麦大枣汤发挥快速抗抑郁作用的机制，并为其临床应用提供依据。
( 致谢: 本研究在南京中医药大学基础医学院中医脑病重点实验室暨转化系统生物学与神经科学研究中心完成，特此致谢！ )
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中国科协主管,中国药理学会主办
文章信息
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-29
- 修订日期: 2016-03-31