心肌梗死是危害人类健康的心血管疾病之一。在疾病研究中，动物模型被广泛用于发病机制和药物治疗研究，模型的有效建立是完成相关实验研究的前提，对研究急、慢性心肌梗死的病理过程、诊断及治疗均有重要意义[1]。结扎冠状动脉左前降支制备心肌缺血模型，是目前应用比较广泛的心肌缺血模型的研究方法。在该模型的定量评价指标中，主要以心肌梗死面积测定为主。需要做心肌组织切片，采用氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)染色显示梗死的心肌组织，拍照，运用相关软件计算每片心肌组织的梗死面积[2]。
这种方法有其局限性：首先，心肌组织的染色程度不好控制，缺乏严格的操作规范标准。染色过轻或者过重，都会导致明显区分梗死区与非梗死区的困难，难以准确定量；其次，在实验研究中，心肌组织不仅只用于梗死范围的测定，还需要进行诸如组织病理学研究、蛋白及RNA水平等多指标的研究。但是一旦心肌组织经过染色后，就很难再用于其它方面的实验研究。在这种情况下，只能将部分实验动物组织用于心肌梗死面积测定，另外的实验动物组织用于其它方面实验研究。这就导致了实验动物的浪费，以及实验动物组内误差的产生。不利于多指标、多时间点的多方面同步研究。
组织会产生自发荧光现象，众多学者应用组织自发荧光进行相关研究[2-7]。田树红等[2]利用Caliper Kinetics IVIS 活体成像系统检测大鼠的组织自发荧光，用于大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的定量分析。Kodak In-vivo Imaging System FX Pro多功能小动物活体成像系统也能检测到较微弱的组织自发荧光，而且能够对荧光强度进行定量分析。本研究运用该系统展示出正常大鼠与心肌缺血损伤大鼠心肌组织的自发荧光情况，更为精确的计算出心肌组织的梗死面积，为大鼠心肌缺血模型的研究及其评价提供定位、定量、多指标观察提供新方法、新依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物及饲养条件Wistar大鼠，清洁级，30只，体质量为240~280 g，♂。购于北京华阜康科技股份有限公司。大鼠饲养于中国中医科学院西苑医院普通动物房。实验动物使用许可证号：SYXK(京)2009-0001，温度21℃～26℃，相对湿度40％～70％，10/14 h明暗交替照明。
1.2 实验动物饲料及饮用水实验动物饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。生活饮用水，经MN-LM 100J型实验动物饮用水处理器生产，符合《生活饮用水卫生标准》。饮水瓶放于饮水瓶专用位置，自由饮水。
1.3 大鼠心肌缺血模型的制备将12只大鼠随机分为2组，正常组和模型组，每组6只。对模型组大鼠采用结扎冠状动脉左前降支制作急性心肌缺血模型。大鼠以10 mL·kg-1腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，仰卧固定于大鼠板上。在大鼠左侧第4、5肋间切口，打开胸腔，撕开心包，轻压胸廓挤出心脏，用0号手术线于左心耳下2mm处结扎冠状动脉左前降支，立即将心脏放回胸腔，关闭切口，缝合皮肤。
1.4 大鼠心肌组织的荧光检测造模后48 h，立即取出心脏，用生理盐水冲洗心腔残留的血液，用滤纸吸干多余液体后，采用Kodak In-vivo Imaging System FX Pro小动物活体成像系统进行荧光检测。将准备好的心肌组织放入快速成像系统内合适的位置，然后进行拍照、数据分析和保存。先对心肌组织进行完整分析；然后再自结扎线以下平行于冠状沟均匀地将心室部分横断切成5片(正常组大鼠于相同位置进行切片)，进行局部分析，以确定损伤的部位和损伤的程度。
1.5 大鼠心肌组织N-BT染色和组织自发荧光检测的比较将正常大鼠和模型大鼠的心脏切片，先用小动物活体成像系统进行荧光检测，然后再进行N-BT染色。对利用快速成像系统得到的自发荧光检测数据和N-BT染色得到结果的数据进行相关性分析。
1.6 组织自发荧光定量分析采用Kodak In-vivo Imaging System FX Pro小动物活体成像系统分析软件对实验结果进行定量分析。
1.7 统计方法用SPSS16.0统计软件进行数据分析。数据用x±s表示，两组之间的比较采用独立样本T检验。
2 结果 2.1 大鼠心肌组织NBT染色与组织自发荧光检测的比较分别将6只正常大鼠和6只心肌缺血损伤大鼠对其心肌组织进行心脏切片，先用小动物活体成像系统进行荧光检测，然后再对心脏组织切片进行N-BT染色。
参照活体成像系统色标，从 Fig 1可以看出，正常组的自发荧光显示蓝色和绿色，模型组大部分区域显示蓝色和绿色，某些部位自发荧光显示黄色和红色；并且，模型组自发荧光图中显示红色和黄色的区域(图中红色箭头所示)，与N-BT染色图中显示心肌缺血的相对部位(图中红色箭头所示)基本吻合。红色区域与坏死心肌组织部位对应，黄色区域与缺血心肌组织部位对应，而蓝色和绿色区域则与正常心肌组织部位对应。通过组织自发荧光与N-BT染色比较，组织自发荧光可以很直观显示出组织的心肌缺血部位和损伤程度，且心肌组织的自发荧光强度和心肌组织的损伤程度直接相关；同时，针对N-BT染色中显示不是很清楚的缺血部位(图中绿色箭头所示)，通过自发荧光检测，也可以很清楚的显示出(自发组织荧光图中绿色箭头所示)。
|
| Fig 1 NBT staining of rat myocardial tissue with spontaneous fluorescence detection Note: A-1,A-2 represent the N-BT staining of the positive and negative side of normal myocardium；B-1,B-2 represent the tissue spontaneous fluorescence of the positive and negative side of normal myocardium；C-1,C-2 represent the N-BT staining of the positive and negative side of injury myocardium；D-1,D-2 represent the tissue spontaneous fluorescence of the positive and negative side of injury myocardium. |
采用小动物活体成像的荧光检测技术对心肌缺血心肌组织进行荧光检测(图示左侧为正常组，右侧为模型组)。通过Fig 2可以看出，正常组大鼠心肌组织自发荧光强度较低，显示绿色和蓝色，表示正常组大鼠心肌组织均处于正常状态；模型组大鼠心肌组织部分部位自发荧光强度较高，有红色和黄色区域出现，表示模型组大鼠心肌组织部分部位均出现了坏死和缺血。
|
| Fig 2 Autofluorescence of ischemia injury of myocardial tissue by Kodak In-vivo Imaging System FX Pro |
通过 Kodak FX Pro活体成像系统对整个心肌组织或者是感兴趣部位的自发荧光强度(Sum Intensity)进行定量分析，所得到的数据再通过SPSS 统计分析软件进行独立样本T检验，比较正常心肌组织和模型组损伤心肌组织的差异是否具有统计学意义。
如 Tab 1 所示，与正常组比较，模型组心肌组织红色区域(坏死部位)、黄色区域(缺血部位)及整个区域自发荧光强度明显增强，且差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；两组绿色和蓝色区域没有明显差异。结果表明，心肌缺血损伤大鼠心肌组织出现了明显的缺血和坏死现象，且与正常组比较差异有统计学意义。
| Zone | Group | ||
| Normal | Ischemia | ||
| Fluorescence | Red zone | 0.05E6±0.12E6 | 3.35E6±1.57E6** |
| Yellow zone | 0.13E6±0.13E6 | 3.26E6±2.97E6* | |
| Sum | Green zone | 15.20E6±7.65E6 | 24.46E6±11.03E6 |
| Intensity | Blue zone | 16.45E6±13.30E6 | 6.05E6±2.70E6 |
| The whole zone | 17.33E6±8.17E6 | 35.12E6±17.53E6* | |
| **P<0.01，*P<0.05 vs normal control group | |||
用多媒体彩色病理图像分析系统分别对N-BT法与组织自发荧光法心肌组织图片，进行每片心肌双侧梗死区面积与整片心肌总面积测定，计算每片心肌梗死区面积占整片心肌总面积的百分比。所得到的数据再通过SPSS 统计分析软件进行独立样本T检验，比较两种方法下正常组与模型组心肌梗死面积占心肌总面积的比例及模型组心肌梗死面积占心肌总面积的比例差异是否有统计学。
Tab 2所示，与正常组比较，N-BT法和组织自发荧光法模型组心肌梗死面积明显增加，且差异有统计学意义(P<0.01)；但是，与N-BT法比较，组织自发荧光法模型组心肌梗死面积没有明显变化。结果表明，两种方法均能准确测定心肌梗死面积。
| Group | The proportion of myocardial infarction area to the total area | |
| N-BT | Tissue spontaneous fluorescence | |
| Normal | 0.0000±0.0000 | 0.0020±0.0039 |
| Ischemia | 0.0692±0.0222** | 0.0669±0.0190** |
| **P<0.01 vs normal control group | ||
心肌缺血模型的造模方法主要以结扎冠状动脉法为主[8]，其中检测心肌梗死范围主要采用定量组织学N-BT染色法[9-12]。虽然这种方法技术比较成熟，但对于心肌梗死的评价方法还有待完善和创新。本研究首次提出用组织自发荧光来评价心肌缺血损伤的心肌组织。
我们通过研究发现，对传统检测指标心肌梗死面积，两种方法没有明显差异，均能显示模型组与正常组的差异具有统计学意义；对组织自发荧光，模型组心肌缺血损伤部位的组织自发荧光强度与正常心肌组织相比明显增强，且实验结果差异具有明显统计学意义。
与N-BT染色比较，自发组织荧光检测具有很多优点：首先，自发组织荧光检测可以更加明显、直观地反映缺血心肌组织的缺血部位及程度。即使N-BT染色不是很清楚的显示缺血区域，自发组织荧光也可以很清楚的显示出来；其次，心肌组织不进行N-BT染色，可以保证心肌组织的完好性，可以继续用于其他方面的研究；再者，同一动物的心肌组织能同时进行应用自发组织荧光进行心肌缺血测定，以及其他方面的实验研究，可以有效消除利用不同动物进行不同方面实验带来的组间差异，使得实验数据更为精准，更为可信。
但是，应用组织自发荧光检测心肌缺血损伤研究，也有其局限性。这种方法对仪器的要求较高。因为组织的自发荧光本身就比较微弱，所以必须是能够检测到较微弱荧光的精密仪器。目前，全世界范围内比较认可的小动物活体成像系统主要有3种，分别是精诺真小动物活体成像系统、柯达小动物活体成像系统、GE小动物活体成像系统。每种仪器的售价均在百万人民币以上。因此，并不是所有实验室都有条件能够开展此项研究。
本次实验，我们采取的是在心肌缺血造模后48h进行的组织自发荧光检测。在造模成功的48h后，无论是N-BT染色，还是组织自发荧光检测，心肌缺血及其导致的坏死都已经比较明显。如果在心肌缺血后不同时间点利用传统N-BT染色与用组织自发荧光进行对比观察，以进一步了解两种方法的特点与优点，可以选择性用于心肌缺血的研究。
基于本次实验的研究结果以及上述假设，本课题组接下来将进一步研究在心肌缺血后急性、亚急性及慢性损伤不同时间内，利用活体成像系统对心肌组织的自发荧光进行检测，以观察在心肌缺血后不同时间内N-BT染色和组织自发荧光变化的连续动态过程及两种方法的优劣。为组织自发荧光在心肌缺血损伤中的应用进一步开拓思路。
(本文实验是在中国中医科学院医学实验中心功能室进行的，非常感谢孙明杰研究员、孙丽华助理研究员的指导和帮助！)
| [1] | 李峰杰, 李贻奎. 心肌梗死动物模型研究进展[J]. 中国药理学通报, 2013, 29 (1) : 5-10 . Li F J, Li Y K. Research progress on animal myocardial infarction model[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29 (1) : 5-10 . |
| [2] | 田树红, 王日超, 邢桂兰, 等. 组织自发荧光在大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤中的应用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (10) : 1473-6 . Tian S H, Wang R C, Xing G L, et al. Application of tissue spontaneous fluorescence in draw focal cerebral ischemia reperfusion injury of rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (10) : 1473-6 . |
| [3] | Lagarto J, Dyer B T, Talbot C, et al. Application of time-resolved autofluorescence to label-free in vivo optical mapping of changes in tissue matrix and metabolism associated with myocardial infarction and heart failure[J]. Biomed Opt Express, 2015, 6 (2) : 324-46 . |
| [4] | Zhan Y T, Li L, Jing W, et al. Serum autofluorescence, a potential serum marker for the diagnosis of liver fibrosis in rats[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13 (9) : 12130-39 . |
| [5] | Zhou G X, Gao C, Xu P, et al. Replication methodology of animalmodels for human disease [M]. Shanghai: Shanghai scientific andtechnological literature press, 2008, : 249 -51 . |
| [6] | Katsuei Shibuki, Ryuichi Hishida, Hiroatsu Murakami, et al. Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence[J]. J Physiol, 2003, 549 (Pt 3) : 919-27 . |
| [7] | Yu Q R, Ahmed A, Heikal. Two-photon autofluorescence dynamics imaging reveals sensitivity of intracellular NADH concentration and conformation to cell physiology at the single-cell level[J]. J Photochem Photobiol B, 2009, 95 (1) : 46-57 . |
| [8] | 卢志强, 张艳军, 崔广智, 等. 心肌缺血模型的制作方法研究进展[J]. 中国药理学通报, 2012, 28 (8) : 1053-7 . Lu Z Q, Zhang Y J, Cui G Z, et al. Progress in preparation methodology of animal models of myocardial ischemia[J]. Chin Pharmacol Bull, 2012, 28 (8) : 1053-7 . |
| [9] | 王金凤, 薄华本, 孟祥颖, 等. 葛花异黄酮对急性心肌梗死小鼠心肌的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2010, 26 (1) : 59-62 . Wang J F, Bo H B, Meng X Y, et al. The protection of isoflavones on myocardium in myocardial infarction mouse[J]. Chin Pharmacol Bull, 2010, 26 (1) : 59-62 . |
| [10] | 王洁, 陆克义, 李险峰, 等. 牛磺酸预处理对大鼠心肌梗死的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2012, 28 (5) : 647-50 . Wang J, Lu K Y, Li X F, et al. Protective effects of taurine preconditioning on myocardial infarction in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2012, 28 (5) : 647-50 . |
| [11] | 杨梅, 寇毅英, 冯伟力, 等. 三味檀香散对大鼠心肌缺血损伤的保护作用及机制[J]. 中国药理学通报, 2008, 24 (4) : 485-8 . Yang M, Kou Y Y, Feng W L, et al. Protective effect and mechanisms of San wei tan xiang powder on myocardial ischemia in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2008, 24 (4) : 485-8 . |
| [12] | 朱雪晶, 李海涛, 喻斌, 等. 人工麝香对抗动物心肌缺血的作用[J]. 中国药理学通报, 2009, 25 (7) : 951-4 . Zhu X J, Li H T, Yu B, et al. Effect of artificial musk on myocardial ischemia in animals[J]. Chin Pharmacol Bull, 2009, 25 (7) : 951-4 . |