2. 药学院;
3. 生命科学院，安徽 合肥 230032
2. College of Pharmacy ;
3. School of Life Sciences, Anhui Medical University, Hefei 230032 China
目前常用的质粒转染技术主要有两种：瞬时转染、稳定转染[1]。稳定转染是将转染的外源性基因整合进入宿主细胞染色体中，实现长期稳定表达，应用较为广泛[2]。实现稳定转染常用的转染方法有磷酸钙法、电穿孔法、慢病毒载体基因转染法、脂质体介导基因转染法等。电穿孔法、磷酸钙法基因转染效率较低；慢病毒载体基因转染法转染率虽高，但存在的潜在危害性较大；脂质体转染法具有低细胞毒性，对多种类型的细胞都具有高转染效率等优点，是目前最常用的转染方法[3]。近年来研究发现，转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)/Smad信号通路在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生发展过程中的作用随阶段不同而异，在HCC早期，TGF-β1可抑制上皮细胞增殖、诱导细胞凋亡，对肿瘤起抑制作用，在HCC晚期则促进肿瘤浸润和转移，推动肿瘤进程，TGF-β信号的双重作用与Smad3的C末端和连接区磷酸化密切相关[4-5]。一方面，TGF-β通过活化I型TGF-β受体(TβRI)使Smad3C末端磷酸化形成pSmad3C，即TβRI/pSmad3C；另一方面，TGF-β可活化促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路，促进Smad3连接区磷酸化为pSmad3L，即MAPK/pSmad3L[5]。TβRI/pSmad3C介导的是肿瘤抑制信号，而MAPK/pSmad3L介导的是致有丝分裂和促进肿瘤发生信号[6]。提示，Smad3的不同位点磷酸化对肿瘤的发生发展起反向调控作用，降低Smad3L磷酸化水平、恢复或提高Smad3C磷酸化水平，可能阻断肝细胞向肝癌细胞转化或肝癌细胞向正常肝细胞转归。有关Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A 3种质粒稳定转染对于HepG2肝癌细胞的增殖、周期及凋亡等功能研究未见相关报道。本研究拟采用脂质体介导基因转染法，将携带Smad3不同位点磷酸化基因的质粒(Smad3 EPSM：Smad3连接区磷酸化位点突变，选择性磷酸化Smad3C；Smad3 3S-A：Smad3 C-末端磷酸化位点突变，选择性磷酸化Smad3L；以正常野生型基因Smad3 WT为对照)转入人肝癌HepG2细胞，建立稳转Smad3 WT-HepG2、Smad3 EPSM-HepG2及Smad3 3S-A-HepG2细胞模型，探讨稳转后不同目的基因的表达对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡等功能的影响。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器DMEM培养基购自美国HyClone公司，新生胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，Recombinant Human TGF-β1购自Peprotech公司，Lipofectamine® LTX and Plus Reagent购自Invitrogen公司，G418、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司产品，Western 及IP细胞裂解液和细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自贝博公司产品，质粒和兔抗pSmad3L抗体源于日本关西医科大学Matsuzaki博士惠赠，兔抗Smad3抗体购自Santa Cruz Biotechnology，兔抗pSmad3C抗体购自Cell Signaling Technology，YJ-1450型医用净化工作台购自北京冠鹏净化设备有限责任公司，Nap-co-6100 型CO2培养箱购自美国杜邦公司，各种规格移液器购自德国Eppendorf公司，多功能酶标仪购自荷兰雷勃公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。
1.2 细胞HepG2细胞株购于中国科学院上海细胞库。
1.3 稳转Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-AHepG2细胞株的构建[7] 1.3.1 G418筛选浓度确定将2.5×108 cells·L-1的HepG2细胞接种于24孔细胞培养板，每孔加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养，24 h后细胞达到80%~90%汇合率，分别加入100、200、300、400、500、600、700、800、900和1 000 mg·L-1浓度的G418培养液。培养7~14 d，细胞全部死亡的最低浓度即为筛选浓度(600 mg·L-1)，维持浓度为筛选浓度一半(300 mg·L-1)。
1.3.2 细胞转染将对数生长期的HepG2细胞接种于6孔板内，过夜培养，当细胞密度为70%~80%时，进行转染。实验分为空白对照组、G418对照组、Smad3 WT转染组、Smad3 EPSM转染组、Smad3 3S-A转染组。取对数生长期的HepG2细胞，操作按脂质体转染试剂盒说明书进行。转染前1 d，接种待转染细胞于6孔板中，调整细胞数为每孔约5×108 cells·L-1×2 ml培养基(含10%胎牛血清，不含抗生素)中。待细胞达到80%~85%融合时转染：分别用250 μL opti-MEM培养基稀释4 μg Smad3 EPSM质粒、Smad3 3S-A质粒、Smad3 WT质粒；250 μL opti-MEM培养基稀4 μL lipofectamine®，并在室温下孵育5 min；将稀释了的质粒和稀释了的lipofectamine®混合，在室温下孵育20 min，促使二者复合物的形成，并在30 min内与HepG2细胞混合孵育；弃去原先6孔板中的培养液，用无血清的培养基冲洗待转染细胞两次，然后在5个孔中每孔分别加入高糖的DMEM(无血清)1.5 mL，再分别加入500 μL混合物，前后左右轻轻晃动培养板使混匀；5% CO2、37 ℃、饱和湿度的CO2细胞培养箱中孵育6 h后，将无血清培养基更换为含10%胎牛血清的DMEM(每孔2 ml)。
1.3.3 G418筛选稳定转染的细胞转染48 h后，细胞用含600 mg·L-1的G418和含10%胎牛血清的培养液筛选2周左右，直到空白对照组细胞完全死亡，然后用含300 mg·L-1的G418和含10%胎牛血清的培养液维持筛选并扩增培养，筛选成功的阳性细胞分别命名为Smad3 WT-HepG2细胞、Smad3 EPSM-HepG2细胞及Smad3 3S-A-HepG2细胞。
1.4 Western blot检测转染细胞株中Smad3、pSmad3C、pSmad3L蛋白水平实验分为转染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞，无(或有)TGF-β1(9 pmol·L-1，1 h)刺激的转染细胞组，和无(或有)TGF-β1(9 pmol·L-1，1 h)刺激的正常HepG2细胞组。分别收集对数生长期HepG2细胞(HepG2)、转染Smad3 WT质粒的HepG2细胞(Smad3 WT-HepG2)、转染Smad3 EPSM质粒的HepG2细胞(Smad3 EPSM-HepG2)、转染Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞(Smad3 3S-A-HepG2)，调整细胞密度至2.5×108 cells·L-1，种瓶(25 cm2培养瓶，4 mL)，待细胞单层铺展面积达80%~90%，更换为无血清DMEM培养基，继续培养24 h，在培养结束前1 h，于相应细胞组加9 pmol·L-1 TGF-β1共培养。培养结束后，提取细胞总蛋白，Western blot检测pSmad3C、pSmad3L、Smad3蛋白水平，以GAPDH为内参[8]。
1.5 MTT比色法检测转染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A质粒对HepG2细胞增殖的影响收集对数生长期HepG2、Smad3 WT-HepG2、Smad3 EPSM-HepG2、Smad3 3S-A-HepG2细胞，调整细胞密度至1.0×104 cells·L-1接种于96孔培养板，每孔200 μL。实验分为HepG2组、HepG2+TGF-β1(9 pmol·L-1)组、Smad3 WT-HepG2组、Smad3 WT-HepG2+TGF-β1(9 pmol·L-1)组、Smad3 EPSM-HepG2组、Smad3 EPSM-HepG2+TGF-β1(9 pmol·L-1)组、Smad3 3S-A-HepG2组、Smad3 3S-A-HepG2+TGF-β1(9 pmol·L-1)组，每组设3个复孔。待细胞单层铺展面积达80%时，更换无血清培养基，继续培养12 h后，于相应组别加9 pmol·L-1 TGF-β1共培养16 h，每孔加MTT(5 g·L-1)20 μL，继续培养4 h，弃孔内上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150 μL，水平摇床上震荡10 min后，置酶标仪上检测各孔吸光度值(A570nm)[9]。实验重复3次。
1.6 流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测转染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A质粒对HepG2细胞周期的影响取对数生长期的HepG2、Smad3 WT-HepG2、Smad3 EPSM-HepG2及Smad3 3S-A-HepG2细胞，调整细胞密度至1.0×108 cells·L-1接种于6孔培养板，继续培养至细胞单层铺展面积达90%时，更换为无血清培养基培养过夜，加9 pmol·L-1 TGF-β1共培养16 h，弃上清液，加PBS洗涤、胰酶消化，收集各组细胞液至EP管中，离心(1 000×g，5 min；下同)沉淀细胞，加预冷的PBS重悬细胞，离心，弃上清，加预冷的70%乙醇固定(4 ℃，过夜)。次日，离心，弃上清，加预冷的PBS洗涤，离心，弃上清，加300 μL预冷的PBS重悬细胞后，加入RNaseA溶液20 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL碘化丙碇(propidium iodide，PI)染液，混匀后4 ℃避光孵育1 h，上流式细胞仪检测细胞周期分布，Multicycles软件分析结果。
1.7 FCM检测转染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A质粒对HepG2细胞周期及凋亡的影响细胞分组及处理同“1.7”，培养结束后收集细胞，采用Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡率，实验操作严格按照试剂盒说明书执行。Cell Questt软件分析实验。
1.8 统计学分析定量资料采用x±s表示，数据统计分析采用SPSS11.0软件处理，两组间比较采用Student’s t-test，多组均数间的两两比较采用One-Way ANOVA。
2 结果 2.1 动态观察各组细胞筛选情况及形态学特征筛选d 1 HepG2细胞呈典型梭形，各组细胞形态基本一致。筛选d 7 G418对照组及转染3种质粒的HepG2细胞组因抗生素G418长期高压筛选作用，细胞有一定死亡。筛选d 14 G418对照组细胞最终全部死亡，而转染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A质粒组细胞仍有大部分存活(Fig 1)。
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| Fig 1 Inverted microscope observing screening solution of each cell results and morphological feature (×200) |
Western blot检测结果显示，与正常HepG2细胞相比，稳定转染3种不同质粒(Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A)组Smad3蛋白的表达量明显增多，TGF-β1刺激后，转染Smad3 WT质粒组细胞pSmad3C/L蛋白水平明显上调；转染Smad3 EPSM质粒组细胞pSmad3C蛋白水平上调明显，而pSmad3L蛋白表达较正常HepG2细胞差异无显著性；转染Smad3 3S-A质粒组细胞pSmad3L蛋白水平明显增加，pSmad3C蛋白水平较正常HepG2细胞微有上调(Fig 2)。上述结果表明，Smad3 WT-HepG2、Smad3 EPSM-HepG2及Smad3 3S-A-HepG2稳转细胞株构建成功，外源性TGF-β1刺激是实现3种质粒稳转HepG2细胞选择性高表达相应目的蛋白的必要条件。
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| Fig 2 The target gene expression level of transfecting Smad3 WT,Smad3 EPSM and Smad3 3S-A plasmids **P＜0.01 vs HepG2 or HepG2+TGF-β1;#P＜0.05,##P＜0.01 vs Smad3 WT+TGF-β1. |
MTT结果显示，转染3种质粒后对HepG2细胞的增殖影响较小，无统计学差异，9 pmol·L-1 TGF-β1刺激16 h后，对正常HepG2细胞，转染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞的细胞增殖均有一定的促进作用(Fig 3)；转染Smad3 EPSM质粒的HepG2细胞，较未转染、转染Smad3 WT或Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞对TGF-β1诱导的细胞增殖反应减弱，差异有显著性，转染Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞，较未转染或转染Smad3 WT质粒组细胞，对TGF-β1诱导的细胞增殖反应略有增强(Fig 3)。提示选择性上调pSmad3C蛋白水平能够抑制HepG2细胞增殖，而上调pSmad3L蛋白水平，可能促进HepG2细胞的恶性增殖。
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| Fig 3 Effects of transfecting Smad3 WT, Smad3 EPSM and Smad3 3S-A plasmids on cell proliferation in different groups stimulated by TGF-β1 **P＜0.01 vs Smad3 EPSM+TGF-β1;#P＜0.05 vs Smad3WT+TGF-β1. |
结果显示，TGF-β1刺激下，转染Smad3 WT质粒的HepG2细胞较正常HepG2细胞周期分布差异无显著性；转染Smad3 EPSM质粒的HepG2细胞，较正常HepG2或转染Smad3 WT质粒的HepG2细胞，表现出明显的G1期阻滞，进入S期细胞数明显减少；转染Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞，较正常HepG2或转染Smad3 WT质粒的HepG2细胞，S期细胞数明显减少，而G2/M期细胞数增多(Fig 4)。提示，选择性上调pSmad3C蛋白水平，诱导HepG2细胞G1期阻滞；选择性上调pSmad3L蛋白水平，促进HepG2细胞由S期进入G2/M期，推动细胞周期进程。
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| Fig 4 Effects of transfecting Smad3 WT,Smad3 EPSM and Smad3 3S-A plasmids on cell cycle distribution of HepG2 cells induce by TGF-β1(x±s,n=3) ##P＜0.01 vs Smad3 WT |
FCM检测结果显示，TGF-β1刺激下，转染Smad3 WT质粒组较正常HepG2细胞组，细胞凋亡率差异无显著性；转染Smad3 EPSM质粒组，较转染Smad3 WT质粒组，细胞凋亡率明显升高(P＜0.01)；转染Smad3 3S-A质粒组，较转染Smad3 WT质粒组，细胞凋亡率明显降低(P＜0.05,Fig 5)。提示，选择性上调pSmad3C蛋白水平，促进HepG2细胞凋亡，而选择性上调pSmad3L蛋白水平抑制HepG2细胞凋亡。
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| Fig 5 Effects of transfecting Smad3 WT,Smad3 EPSM and Smad3 3S-A plasmids on apoptotic rate of HepG2 cells induce by TGF-β1 (x±s,n=3) #P＜0.05,##P＜0.01 vs Smad3 WT |
TGF-β是一类对于细胞生长、增殖、分化、凋亡等生命活动均具有调节作用的多功能细胞因子[10]。TGF-β首先结合靶细胞膜上的TGF-β受体，受体活化，进而磷酸化胞质中的Smad蛋白，磷酸化的Smad蛋白异位入核，调控靶基因的转录，最终影响靶细胞的生物学功能[11]。目前研究表明，Smad3是参与TGF-β信号胞内提取和转化的关键节点，依赖TβRI活化的Smad3 C-末端(即pSmad3C)，介导的是肿瘤抑制信号；依赖丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的Smad3连接区(即pSmad3L)，介导的是致有丝分裂或促肿瘤发生信号[12]。临床研究发现，最终发展成为HCC的慢性乙肝及慢性丙肝患者肝组织中pSmad3L大量表达，而pSmad3C则表达有限；反之，pSmad3C大量表达，而pSmad3L表达有限的慢性乙肝及丙肝患者则不发展为HCC[13]。提示，在HCC发生发展过程中，pSmad3L发挥着类似癌基因的作用，而pSmad3C扮演着抑癌基因的作用。
随着分子生物学技术的发展与革新，基因水平的干预或基因治疗，已逐渐成为人类防病治病的应对策略。脂质体转染、慢病毒转染技术的逐步成熟，帮助人类实现外源基因导入宿主细胞转录翻译，产生功能蛋白而调控靶细胞生物学功能的设想。本实验中，采用脂质体转染法将携带正常Smad3基因的质粒Smad3 WT、连接区磷酸化位点突变的Smad3基因的质粒Smad3 EPSM、C-末端磷酸化位点突变的Smad3基因的质粒Smad3 3S-A导入人肝癌细胞株HepG2，倒置显微镜动态观察筛选过程，结果显示，筛选d 14转染组细胞仍有部分存活，而未转染组几乎全部死亡，因为转入细胞的质粒中含有抗性基因neo，其携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变为无毒形式，而未转染组不含抗性基因neo，推测可能获得稳转细胞株。Western blot法对筛选结果作进一步验证，结果显示，TGF-β1刺激下，转染相应质粒的HepG2细胞选择性高表达相应质粒携带的目的基因蛋白，提示，已成功获得Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A稳转HepG2细胞株。
随后，初步探究了转染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A质粒后HepG2细胞的功能学。结果显示，单纯转染3种质粒后对HepG2细胞功能几乎没有影响；与转染野生型质粒经TGF-β1刺激后相比，当Smad3C末端磷酸化位点突变，经TGF-β1刺激仅pSmad3L蛋白表达，能明显抑制HepG2细胞增殖、诱导HepG2细胞G1期阻滞和促进HepG2细胞凋亡，当Smad3链接区末端磷酸化位点突变，经TGF-β1刺激仅表达pSmad3C蛋白，对HepG2细胞增殖略有促进作用、诱导HepG2细胞由S期向G2/M期转变，并抑制HepG2细胞凋亡。提示，转染3种质粒本身对细胞本身影响较小，选择性上调HepG2细胞中pSmad3C、pSmad3L蛋白水平，可影响HepG2细胞的增殖，推测选择性增加pSmad3C蛋白水平可能通过诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡，从而抑制肝癌细胞的增殖，发挥抗癌作用；选择性上调HepG2细胞中pSmad3L蛋白水平，可能通过促进细胞周期进程和抑制细胞凋亡，从而促进肝癌细胞的恶性增殖，发挥促癌作用。
本研究证实了在HepG2细胞中选择性调控pSmad3C/L蛋白水平或含量比值，能够改善癌细胞的恶性程度，可能促进癌细胞向正常细胞转归。而研究中建立的Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A稳转HepG2细胞株，为下一步本课题组在细胞和分子水平研究能够经由pSmad3C/pSmad3L调控的药物奠定基础。
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