他汀类药物是羟甲戊二酰辅酶A(HMGCR)选择性抑制剂，是临床防治冠心病的重要药物[1, 2]。研究表明，阿托伐他汀能升高肝脏中胆固醇7羟化酶(Cyp7a1)的表达，改变体内胆汁酸代谢[3],并可能与其长期使用所致肝脏不良反应有关[4]。Cyp7a1表达受时钟基因的调控，具有昼夜节律性[5]。本研究采用长期给予临床剂量阿托伐他汀，观察其对小鼠肝Cyp7a1基因和时钟基因表达的影响。
1 材料与方法 1.1 药品、试剂和实验动物阿托伐他汀，Topfond Pharmaceutical Limited by Share Ltd；TRIzol、逆转录试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；SYBR Green，百乐中国公司。
♂昆明种小鼠，(20±2)g,由第三军医大学实验动物中心提供，饲养于遵义医学院SPF程控环境(许可证号：SYXK 黔 2014-003)，维持光照8 ∶00~20 ∶00。随机分为对照组和阿托伐他汀组，阿托伐他汀组每天早上9 ∶00 ig给予10 mg·kg-1阿托伐他汀，每天1次，连续90 d。最后1次给药1 h后收集血和肝组织。
1.2 肝毒性检测血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆汁酸(TBA)用试剂盒测定。称取肝湿重，计算肝指数。取肝大叶组织，切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织的病理变化。
1.3 实时荧光定量PCR检测相关基因mRNA表达肝组织50 mg采用TRIzol提取总RNA，用Nanodrop测总RNA的浓度与质量，进行逆转录，用SYBR Green PCR扩增(40循环)，以β-actin作为内参，用相对定量法进行分析。
1.4 统计学分析实验结果数据以x±s表示，采用SPSS 18.0统计软件，单因素方差分析进行统计分析。
2 结果阿托伐他汀组小鼠体重、肝重、肝指数、ALT、总胆汁酸、肝脏病理切片均与正常对照组无明显差异。 AST有一定程度的升高，但属正常范围。阿托伐他汀组炎症基因Egr1和mCK表达较对照组小鼠略有升高，但差异无统计学意义(Tab1)。
| Group | Liver index | ALT | AST | TBA | Egr1 | mCK |
| Control | 49.2±1.28 | 36.7±0.48 | 44.4±0.68 | 22.9±0.19 | 100±30.7 | 100±10.5 |
| Atorvastatin | 49.3±1.42 | 35.3±0.84 | 55.3±0.61* | 23.3±0.20 | 178±56.4 | 128±11.2 |
| *P<0.05 vs control | ||||||
阿托伐他汀组小鼠肝组织中Cyp7a1的表达明显高于对照组(P＜0.05)。阿托伐他汀能够增加核心基因Bmal1和Clock的表达(P＜0.05)，但对负反馈基因Cry1、Per2以及与胆酸代谢相关的目标基因Dbp、Nr1d1的表达无明显作用(Tab2)。
| Group | Cyp7a1 | Bmal1 | Clock | Cry1 | Per2 | Dbp | Nr1d1 |
| Control | 100.0±19.3 | 100.0±27.3 | 100.0±13.5 | 100.0±7.3 | 100.0±23.8 | 100.0±32.1 | 100.0±21.4 |
| Atorvastatin | 286.3±40.8* | 300.4±54.5* | 177.8±26.3* | 127.3±8.7 | 65.7±12.2 | 82.9±25.4 | 113.2±14.1 |
| *P<0.05 vs control | |||||||
本实验结果显示，长期给予临床剂量阿托伐他汀安全性较高，不引起明显的肝功能异常，但可增加Cyp7a1的表达。
肝脏胆酸代谢和Cyp7a1基因的表达均呈现昼夜节律性[5, 6]。时钟基因调控的机制主要包括核心基因Clock、Baml1的表达，负反馈基因Per、Cry和Nr1d1的反馈调节和目标基因Dbp的表达[7]。我们的实验结果显示，长期灌胃给予阿托伐他汀后能升高小鼠肝组织中核心基因Clock和Bmal1的表达，而对负反馈基因Cry1、Per2以及目标基因Dbp、 Nr1d1无明显作用。
时辰药理学是药物作用的一个新靶点，为阿托伐他汀的药理研究提供了一个新的关联。
| [1] | 张玲玲,金 英,隋海娟. 阿托伐他汀对Aβ1-42诱导的大鼠AD模型保护作用及其机制研究[J]. 中国药理学通报,2014,30(2): 270-4. Zhang L L,Jin Y,Sui H J. Protective effects of atorvastatinon Aβ1-42-induced AD model rats and its mechanism[J]. Chin Pharmacol Bull,2014,30(2):270-4. |
| [2] | 李 敏,孙 玲,李红玲,孙黔云. 阿托伐他汀减轻氧化型低密度脂蛋白导致的人微血管内皮细胞活化和损伤[J]. 中国药理学通报,2014,30(5):679-83. Li M,Sun L,Li H L,Sun Q Y. Atorvastatin attenuates activation and injury of human microvascular endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein[J]. Chin Pharmacol Bull,2014,30(5):679-83. |
| [3] | Fu Z D,Cui J Y,Klaassen C D. Atorvastatin induces bile acid-synthetic enzyme Cyp7a1 by suppressing FXR signaling in both liver and intestine in mice[J]. J Lipid Res,2014,55(12): 2576-86. |
| [4] | 曾含清,张 琼,彭文兴. 阿托伐他汀致肝损伤的机制[J]. 药物不良反应杂志,2012,14(4): 232-6. Zeng H Q,Zhang Q,Peng W X. Mechanism of atrovastatin-induced liver injury[J]. Adverse Drug React J,2012,14(4): 232-6. |
| [5] | Noshiro M,Usui E,Kawamoto T,et al. Multiple mechanisms regulate circadian expression of the gene for cholesterol 7alpha-hydroxylase(Cyp7a),a key enzyme in hepatic bile acid biosynthesis[J]. J Biol Rhythms,2007,22(4): 299-311. |
| [6] | Ma K,Xiao R,Tseng H T,et al. Circadian dysregulation disrupts bile acid homeostasis[J]. PLoS One,2009,4(8): e6843. |
| [7] | Dallmann R,Brown S A,Gachon F. Chronopharmacology: new insights and therapeutic implications[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol,2014,54: 339-61. |