α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)是目前在基础研究中广泛被应用为养料来营救因营养缺失导致的细胞生长抑制[1]。据报道，在多种代谢酶发生突变如IDH1或SDH突变的肿瘤细胞中，当应用DM-2KG干预后，这类代谢物进入细胞后即可转化为PHD活化的辅助因子α-KG，激活PHD酶活性，促进缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白降解[2]，即HIF-1α蛋白的PHD经典降解途径。
在常氧且营养成分充足的条件下，DM-2KG不仅没有促进癌细胞的生长，反而抑制癌细胞的生长，并能诱导产生一组干细胞样的癌细胞[3]。本文深入探讨其中的发生机制。
1 材料与方法 1.1 材料DM-2KG、去铁胺、二甲基草酰甘氨酸和环己酰亚胺(Sigma公司)；MG132( Calbiochem公司)。其他：HIF-1α (BD Bioscience),HIF-2α (Novus Biologicals),anti-Actin (Millipore)，anti-CD44(Cell Signaling)，anti-Ki67 (Abcam)，Hoechst 33342 (Sigma)，Image-Pro6.3软件(Media Cybernetics)，Gallios流式细胞仪(Beckman)，TD-20e光度计(Turner)。
1.2 方法采用无目标基因的shRNA转染MDA-MB-231细胞作为对照和针对HIF-1α的shRNA-沉默MDA-MB-231细胞(MDA-MB-231/shHIF-1α)。采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Cell Signaling)检测细胞衰老状况。根据产品使用指南用ENLITEN ATP Assay System (Promega,FF2000) 测定ATP产量。采用免疫荧光染色和流式细胞术检测细胞表面的CD44标志物；免疫荧光染色和成像技术检测细胞总CD44标志物。采用乳腺细胞球形成试验评估癌细胞致瘤能力。
1.3 统计学方法数据结果为x±s。对两组计量资料的统计学检验采用Student’s t-test；对多组计量资料的统计学检验采用One way ANOVA。
2 结果 2.1 DM-2KG抑制乳腺癌细胞生长经DM-2KG培养至10 d，DM-2KG明显抑制MDA-MB-231细胞增殖及细胞内ATP生成，也可抑制乳腺癌细胞株MCF7的集落生成大小和数量。MDA-MB-231细胞除癌细胞集落生成受抑制外，癌细胞的形态出现明显的肥大。将获取的生长抑制的癌细胞集落在没有DM-2KG的培养液中重新培养10 d，癌细胞恢复了增殖和细胞集落形成能力。采用与衰老相关的β-半乳糖苷酶试验也证实所获取的生长抑制的癌细胞并非衰老细胞，提示DM-2KG诱导的具备增殖可逆性的生长停滞癌细胞是一静止休眠期细胞亚群。在营养成分充足的培养液中，DM-2KG对癌细胞的生长起抑制作用。
2.2 DM-2KG诱导乳腺癌细胞高表达CD44采用Ki67low和Hochest 33342low双染法来标记静止休眠期细胞(G0细胞)。MDA-MB-231细胞经DM-2KG干预4 d后，和对照组比较，G0细胞的比例从12.7% 增大到 24.5%，干预7 d，比例增至31.3%。在MCF7细胞观察到相似结果 (28.3% vs 45.3%)。可见，乳腺癌细胞经DM-2KG干预后可促进癌细胞向G0静止休眠期细胞转化。并且MDA-MB-231细胞表面表达的CD44水平增加呈时间依赖性趋势。同样在MCF7细胞，DM-2KG也可诱导癌细胞表面CD44高表达。可见DM-2KG可抑制乳腺癌细胞的增殖，并诱导产生一群细胞大小增大、细胞表面高表达肿瘤干细胞标志物CD44的静止休眠期细胞。
2.3 DM-2KG诱发乳腺癌细胞静止休眠状态和干细胞样表型是HIF-1α介导验证MDA-MB-231/shHIF-1α细胞HIF-1α的敲减效率，采用两株经shRNA干预过的MDA-MB-231细胞进行干预。经DM-2KG干预7 d后，MDA-MB-231/shCON细胞和MDA-MB-231/shHIF-1α细胞相比，前者可明显获取更多的静止休眠亚群癌细胞。DM-2KG明显增加了MDA-MB-231/shCON 细胞总CD44蛋白的表达，而对于MDA-MB-231/shHIF-1α细胞，DM-2KG干预前后，总CD44蛋白水平基本没有太大改变，提示DM-2KG 上调乳腺癌细胞高表达 CD44 是受HIF-1α介导的。可见，HIF-1α 在DM-2KG 诱发干细胞样癌细胞的过程中发挥重要作用。
3 讨论乳腺癌治疗过程中常出现耐药情况，导致多疗程化疗后疗效变差，对信号通路的研究成为耐药机制研究的一大热点[4]。本研究证实常氧条件下，DM-2KG作用于乳腺癌细胞后会使细胞出现假缺氧反应，并诱发癌细胞出现两个结局：① DM-2KG抑制乳腺癌细胞的生长，诱发一亚组处于静止期的癌细胞；② DM-2KG诱发一肿瘤干细胞样的癌细胞亚群，该亚群癌细胞具有自我更新，高致瘤能力等的特点。HIF-1α蓄积会导致乳腺癌细胞增殖停滞，DM-2KG不仅可以调控乳腺癌细胞向干细胞样癌细胞转化，而且通过其诱导产生的HIF-1α使一群乳腺癌细胞转化成干细胞样癌细胞状态，而且这群癌细胞具备有强致瘤能力和高肿瘤增殖力。推测DM-2KG通过HIF-1α诱发产生的静止期癌细胞可能是乳腺癌细胞向干细胞样癌细胞转化过程中的一个重要条件。代谢物DM-2KG可以通过调节HIF-1α的蛋白水平而诱导产生干细胞样癌细胞。
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