2. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001
2.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process,Lianyungang,Jiangsu 222001,China
痛经是目前妇科最常见的疾病，严重影响了妇女的正常工作和生活质量。研究表明，痛经与PGF2α的水平直接相关[1]，临床多用非甾体抗炎药来治疗痛经，但是在肝、肾、消化系统方面往往出现副作用。因此，用中药治疗痛经是一个不错的选择[2]。
散结镇痛胶囊组成为龙血竭、三七、浙贝母、薏苡仁，具有软坚散结，化瘀定痛的功效。本实验利用原代培养的小鼠子宫平滑肌细胞，建立PGF2α致其收缩模型来考察散结镇痛胶囊对原代小鼠子宫平滑肌细胞收缩的变化影响，为探讨其治疗痛经的机制提供依据。
1 材料 1.1 仪器与设备超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-2F型)，二氧化碳培养箱(Thermo scientific 3100)，倒置显微镜(OLYPUS ，CKX41SF)，黑色底透96孔细胞培养板(美国Costar)，细胞培养瓶(美国Costar)，移液枪(Eppendorf)，高压蒸汽灭菌锅(BXM-30R立式压力蒸气灭菌锅)，离心机(北京众益中和生物技术有限公司，LD4-2A)，细胞自动计数仪(Invitrogen，c1028)，倒置荧光显微镜(DMI4000B)，高内涵检测仪(ArrayScanⅦ)，Flexstation®3钙流工作站(MD)。
1.2 材料与试剂DMEM/F12培养基、胶原酶Ⅱ(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶、EDTA、多聚甲醛(AMRESCO)，青霉素/链霉素混合液(Biotopped)，平滑肌肌动蛋白(anti-α-actin)、CaM、MLCK(Abcam)，p-MLC20、Alexa Fluor® 488 Conjugate、DRAQ5®(CST)，羊血清(武汉柏世德)，Hoechst 33258、前列腺素F2α(Sigma)，Calcium 6-QF Assay Kit(MD)，苯甲酸雌二醇注射液(上海通用药业股份有限公司)，Triton X-100(生工生物)，HCS CellMask Deep Red stain(life)。
1.3 动物♀ ICR小鼠，7~8周龄，购于扬州大学比较医学中心，SCXK(苏)2012-0004。
2 方法 2.1 样品的制备用DMSO溶解，配制成浓度为12.5 g·L-1的母液。
2.2 小鼠子宫平滑肌细胞的原代培养与鉴定[3, 4]ICR ♀ 小鼠注射苯甲酸雌二醇注射液2 d(每只注射0.1 mg)。ICR ♀小鼠脱颈处死，75%酒精消毒，取出子宫置于新添入双抗的PBS中。剥离脂肪、结缔组织，纵向剪开子宫，手术刀轻轻刮除子宫内膜，PBS冲洗1~2遍。弃去缓冲液，眼科剪将肌条剪成1~2 mm3碎糜，加入2 mL 0.025 g·L-1的胶原酶Ⅱ转移入锥形瓶，5 mL胶原酶Ⅱ清洗剪刀。移锥形瓶于37℃水浴锅消化1 h，隔0.5 h巴氏吸管吹打5 min。等体积含15%血清的完全培养基停止消化，200目细胞筛过滤，滤液1 000 r·min-1×10 min离心，弃上清，完全培养基混悬细胞，接种入25 cm2细胞瓶培养。
隔2 d，PBS清洗2遍，弃去死细胞和杂质，加入完全培养基，于37℃、5% CO2细胞培养箱继续培养。细胞培养至d 5，弃上清，加入2 mL 0.025 g·L-1胰蛋白酶+0.002 g·L-1 EDTA消化5 min，等体积完全培养基停止消化，1 000 r·min-1×3 min离心，弃上清，加入完全培养基，混悬细胞，接种于96孔板。于37℃、5% CO2细胞培养箱培养过夜。弃上清，PBS洗1遍，0.4 g·L-1多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，用封闭液5%山羊血清/0.3% Triton X-100封闭1 h。加入平滑肌肌动蛋白(anti-α-actin)一抗(1 ∶300)，4℃过夜。次日平衡至室温，Alexa Fluor® 488 Conjugate(1 ∶1 000)室温孵育1 h，PBS清洗3遍，Hoechst 33258(2 μg·L-1)复染10 min，PBS清洗1遍，倒置荧光显微镜拍摄，以胞质出现亮绿色为阳性结果，同时计算阳性百分率。阴性对照不加一抗，只加抗体稀释液。镜下划分4个区域，数蓝色细胞核，利用显绿色的细胞总数%4个区域的染核细胞数，得到阳性百分率。
2.3 钙离子检测细胞传代，以1×108·L-1密度种板于黑色96孔板，于37℃、5% CO2细胞培养箱培养过夜。弃上清，加入100 μL Calcium 6-QF溶液，37℃孵育2 h。按需要分为空白组、模型组和给药组。空白组和模型组加入50 μL的 PBS，给药组加入PBS配制的散结镇痛胶囊溶液(终浓度为12.5 g·L-1)50 μL，作用15 min。Flexstation®3钙流工作站检测动态钙离子变化：仪器设置成运行20 s后空白组加入50 μL PBS，其余各组加入PGF2α(终浓度为420 nmol·L-1)50 μL，测定100 s内钙离子的变化。
2.4 细胞收缩检测[5]细胞传代，以3×107·L-1密度种板于黑色96孔板，于37℃、5% CO2细胞培养箱培养过夜。按需要分为空白组、模型组和给药组。空白组和模型组加入无血清培养基100 μL，给药组加入无血清培养基配制的散结镇痛胶囊溶液(终浓度为12.5 g·L-1)100 μL，作用1 h。弃上清，空白组加入无血清培养基100 μL，模型组和给药组加入PGF2α(终浓度为420 nmol·L-1)100 μL作用1 h。弃上清，0.4 g·L-1多聚甲醛固定，室温孵育15 min，弃上清，PBS洗板3次。加入0.1% Triton X-100溶液100 μL，室温孵育15 min，弃上清，PBS洗板3次。加入100 μL HCS CellMask Deep Red stain，室温孵育30 min，弃上清，PBS洗板3次，高内涵仪器检测成像。
2.5 蛋白表达水平的检测细胞传代，以4×107·L-1密度种板于黑色96孔板，于37℃、5% CO2细胞培养箱培养过夜。按需要分为空白组、模型组和给药组。空白组和模型组加入无血清培养基100 μL，给药组加入无血清培养基配制的散结镇痛胶囊溶液(终浓度为12.5 g·L-1)100 μL，作用1 h。弃上清，空白组加入无血清培养基100 μL，模型组和给药组加入PGF2α(终浓度为420 nmol·L-1)100 μL作用1 h。弃上清，0.4 g·L-1多聚甲醛固定15 min，PBS洗5 min×3次，用封闭液5%山羊血清/0.3% Triton X-100封闭1 h。分别加入CaM、MLCK、p-MLC20(1 ∶200)一抗，4℃过夜。次日平衡至室温，Alexa Fluor® 488 Conjugate(1 ∶1 000)室温孵育1 h，PBS清洗3遍，DRAQ5®复染5 min，PBS洗板1遍，高内涵仪器成像。
2.6 统计学分析实验结果采用SPSS 13.0软件分析结果。组间数据应用单因素方差分析结果。
3 结果 3.1 小鼠子宫平滑肌细胞的鉴定为了鉴定小鼠子宫平滑肌细胞的纯度，用平滑肌细胞特异的肌动蛋白进行免疫荧光染色后，用Hoechst 33258复染。Fig1染色结果表明：平滑肌细胞肌动蛋白存在于细胞质，绿色荧光为阳性染色，主要分布在胞质区域。细胞核在复染后呈蓝色。数出细胞总数和免疫染色阳性细胞数。统计结果表明，平滑肌细胞纯度在99%以上。阴性对照未呈现绿色荧光。
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| Fig.1 Identification of mouse myometrial smooth muscle cells A:Unstained USMCs; B: USMCs stained by Hoechst 33258; C: USMCs stained by anti-α-actin |
药物作用15 min后，直接上机检测钙离子的荧光强度，稳定20 s后，仪器直接加入相应液体，空白组20 s后的曲线因体积变化，荧光值有所增加。模型组和药物组20 s后曲线因体积变化先升高，又因加入PGF2α，曲线降低。药物组预给药后，曲线回升要高一些。Fig2结果显示，与空白组比较，模型组差异有显著性；与模型组比较，散结镇痛胶囊(12.5 g·L-1)组差异有显著性，能明显抑制USMCs内钙离子的内流(P≤0.05)。
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| Fig.2 Inhibitory effects of SJZT capsule on[Ca2+]i induced by prostaglandin F2α *P≤0.05 vs control；#P≤0.05 vs PGF2α |
预给药散结镇痛胶囊后进行造模1 h，Fig3结果显示，与空白组比较，模型组细胞面积明显缩小；与模型组比较，散结镇痛胶囊组明显扩张，能明显抑制PGF2α引起的细胞收缩(P≤0.01)。
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| Fig.3 Inhibitory effects of SJZT capsule on contraction induced by prostaglandin F2α **P≤0.01 vs control;##P≤0.01 vs PGF2α |
免疫荧光结果显示(Fig4)，与空白组比较，模型组蛋白明显上调；与模型组比较，散结镇痛胶囊组明显下调，能明显降低CaM、p-MLC20的蛋白表达水平(P≤0.05，P≤0.01)，MLCK的表达有降低趋势，差异无显著性。
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| Fig.4 Levels of CaM,MLCK,p-MLC20 induced by prostaglandin F2α *P≤0.05，**P≤0.01 vs control；#P≤0.05，##P≤0.01 vs PGF2α |
散结镇痛胶囊临床上用来治疗原发性痛经、子宫肌瘤、慢性盆腔炎包块、子宫内膜异位症等具有较好的疗效，能明显抑制PGF2α的含量[6, 7]。平滑肌细胞内钙离子主要储存在肌浆网[8]，作为在细胞收缩中起重要作用的第二信使，刺激后可通过细胞内钙离子的释放和胞外的内流，引起钙离子浓度的升高。
平滑肌的收缩是通过细胞内钙离子的浓度来调节的[9]，我们拟从平滑肌收缩角度考察散结镇痛胶囊对原代小鼠子宫平滑肌细胞的钙离子变化影响，以期对其治疗原发性痛经等机制能有进一步的阐述。
根据文献报道，我们简化了原代培养小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养方法，得到的细胞纯度较高。实验室观察发现，原代培养的细胞至完全融合需要5~7 d，此后每隔5 d传代1次，目前已传代到第11代。同时我们也做了细胞冻存，与不断传代的细胞相比，复苏后的细胞活力明显要差一点，但是传代后不影响使用，这为后续筛选散结镇痛胶囊的有效部位提供了保证。
高内涵筛选技术在药物研发的初筛、机制研究和安全性评价方面具有重要作用，能将药物对活细胞的作用进行图像采集，通过软件进行数据分析得到实验结果[10]。通过高内涵仪器分析读取染色后的细胞面积，我们可以快速观察到给药前后细胞整体的形态变化。
原代小鼠子宫平滑肌细胞同批次提取得到的蛋白不足以进行蛋白印迹实验，故而采用高内涵仪器进行蛋白免疫荧光实验。当平滑肌细胞内Ca2+浓度升高，与CaM结合，激活MLCK激酶，激酶继续催化MLC20发生磷酸化反应，构象改变，导致平滑肌收缩[11]。
实验中用PGF2α刺激原代小鼠子宫平滑肌细胞，引起了CaM、MLCK、p-MLC20水平的升高，给予散结镇痛胶囊后，蛋白均有下调，说明其确实可以抑制细胞的收缩，可能具有缓解疼痛的作用。
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