药对是中药配伍形式中的一种，从某种角度上讲，药对的配伍与应用具有特别的意义。所谓中药药对又称对药、对子药、姐妹药，专指临床上常用的相对固定的两味药物的配伍形式，是中药配伍中的最小单位^[1]。由于研究单味药难以反映出其在复方中的真实作用，而复方由于药味多，作用关系复杂，对其研究也难以得出准确结论。“药对”作为药配伍中的雏形，对其研究恰好可以弥补上述不足。复方中的核心药对，在中药理论中具有相互增效并调和药性，引药归经的作用。

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种自身免疫性疾病。研究认为，SLE 的发生主要由于先天肾阴亏虚，以致五脏之精生化乏源，形成以阴虚内热为本的狼疮体质^[2]。根据病因病机特点，结合症状分析，及古代医家选方用药特点，辨证论治，范永升等^[3]确立了解毒祛瘀滋阴疗法，按照以法制方的原则，通过处方、药物筛选及临床经验，确立解毒祛瘀滋阴方，青蒿、鳖甲为该方的核心组分，两药相配，有“青蒿不能直入阴分，有鳖甲领之入也；鳖甲不能独出阳分，青蒿领之出也”之妙。

代谢组学借助高通量、高灵敏度与高精确度的现代技术，分析生物样本如血液、尿液中的内源性代谢物，可以根据代谢物的变化，发现生物标志物，阐明药物作用的整体效应，包括协同作用，其思想具有与中医理论整体观念相一致的特点。作为系统生物学的重要组成部分，代谢组学已被广泛应用于各类复杂疾病的作用机制研究^[4]。其中，超高效液相质谱联用(UPLC/Q-TOFMS)是目前用于分析的一种强有力的方法^[5]。本实验拟选择解毒祛瘀滋阴方中的青蒿、鳖甲作为药对配伍，应用代谢组学技术研究其干预狼疮鼠后血清代谢标志物的变化规律，筛选、鉴定与疾病相关的代谢标记物，探讨青蒿-鳖甲药对对SLE的治疗机制。

2月龄C57BL/6 小鼠12 只，MRL/lpr 狼疮鼠36只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号: SCXK(沪) 2012-0002，实验用基础饲料由浙江中医药大学动物实验中心提供^[6]。

青蒿、鳖甲生药材由浙江中医药大学饮片厂提供。青蒿鳖甲提取液由浙江中医药大学附属医院制剂室制备(浓度：含生药量0.5 g每毫升)，-20℃保存备用^[6]。甲酸(分析纯，阿拉丁公司)，甲醇(色谱级，美国Tedia 公司)，乙腈(色谱级，美国Tedia公司)，质谱参比液和校准液为美国安捷伦公司所提供。

1260 infinity 高效液相色谱仪，Eclipse Plus C18色谱柱，Agilent 6520 Q-TOF /MS 质谱系统，均购自美国Agilent公司；Centrifuge 5417R 高速冷冻离心机(德国，Eppendorf 公司)；Milli-Q Biocel 纯水仪(美国，Millipore 公司)；Mass Hunter 软件(美国，Agilent Technologies 公司)；Mass Profiler Professional(MPP) 软件(美国，Agilent Technologies 公司)。

36只MRL/lpr小鼠♀，12只C57BL/6小鼠♀，由浙江中医药大学动物实验中心饲养(SPF级)。适应性喂养1 周后，分为对照组(C57BL/6小鼠)、模型组及青蒿-鳖甲治疗组(低、高剂量)。对照组及模型组每日灌胃生理盐水1次，每只0.5 mL。低、高剂量组以相当于正常成人每日用量5、10倍剂量给药，分别为0.1、0.2 mL·(10 g)^-1(水煎液)，每日1次，连续饲养用药2个月。采血前小鼠禁食12 h，眼球取血，收集血液3 000 r·min^-1离心15 min，分离血清，-80 ℃保存备用^[6]。

血清样本在室温下解冻后，离心后取出100 μL，加入300 μL 乙腈沉淀蛋白^[7]，涡旋震荡 1 min，静置 10 min，然后4℃低温高速离心10 min (12 000 r·min^-1)，400 μL 血清样品用0.22 μm微孔滤膜过滤，弃去初始滤液，样品即可进行液相质谱分析。从4个实验组样本中抽取等体积血清混合制成质控样本，前处理方法与待测样本相同。

依据本实验室前期建立的条件进行优化，最终确定的色谱条件：流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脱(0～2 min，20% B；2～13 min，20%～75% B；13～18 min，75%～85% B；18～25 min，85%～95% B)，后运行时间为 5 min。自动进样器温度为4 ℃，柱温为 35 ℃。

对质谱系统进行优化，优化后的主要参数是：采用电喷雾离子源 ESI 正离子模式。扫描范围m/z 50～1 000，干燥气为N₂，干燥气温度为350 ℃，正离子模式毛细管电压分别为4 000 V，碎裂电压为170 V，锥孔电压为65 V，雾化器压力为275.8 kPa。使用 Centroid 模式保存质谱数据，数据采集速率为 2 spectrum·s^-1。数据采集过程中，参比液实时监测校准质谱系统。二级质谱数据采集时，碰撞能分别设置为 40 eV，二级质谱采集速率为 2 spectrum·s^-1[8]。

使用Agilent Mass Hunter 分析软件中分子特征提取 (molecular feature extraction，MFE)处理代谢物信息。提取离子丰度阈值为 200，基峰丰度阈值为1 000，正离子模式加和离子种类为[M+H]⁺。提取后代谢物信息包括保留时间、精确质量数和丰度，将提取后的数据转存为CEF格式文件，利用 MPP 软件进行数据预处理。使用PLS-DA的载荷图筛选出对分类贡献较大的化合物，进一步通过VIP(variable importance in projection)值(＞1.5)确定生物标志物，利用方差分析对数据进行统计学分析。利用PLS-DA对数据矩阵进行模式识别。根据精确的质量数和二级质谱图，利用METLIN、HMDB和PubChem等数据库鉴定潜在标记物。

如Fig1所示，实验得到各组血清样本的TIC图之间存在一定差异。为保证数据的可靠性，在采集过程中，每间隔8个样本进样一次质控样本，以监测系统的稳定性。分析质控样本的TIC 图，分保留时间(前、中、后)，采用5个特征峰的离子精确质量、保留时间和峰面积数据。结果显示，所选特征峰的保留时间偏移＜0.01 min，各个峰面积RSD＜10%，精确质量的数漂移值小于2 ppm。由此可见，在血清样本数据采集过程中，系统稳定，采集数据可靠。

Fig.1 Representative TIC chromatograms of control group(A),SLE model group(B) and Qinghao-Biejia treatment group[low(C)and high(D)dose]

图选项

对4组小鼠的代谢图谱进行PCA主成分分析(Fig2)，发现SLE模型组和对照组明显地分离，说明2 组小鼠血清中代谢物种类或者数量上存在一定差异。在此基础上，我们进一步采用PLS-DA对各组数据进行分型，由得分图结果可以看出(Fig3)，SLE组较对照组有明显的向左偏移。青蒿-鳖甲配伍治疗后，代谢图谱偏移得到有效的缓解，治疗组与对照组在得分图中趋于靠近，表明代谢产物差异相对减小，说明青蒿-鳖甲药对配伍对SLE小鼠有治疗作用。

Fig.2 Score plots of PCA analysis in positive ion mode

图选项

Fig.3 Score plots of PLS-DA analysis in positive ion mode

图选项

根据差异代谢物的精确相对分子质量和二级质谱图，鉴定差异代谢物。其中10种差异代谢物得到鉴定(Tab1)，各个差异代谢物在各组中的峰面积变化如Fig4所示。

血清中代谢物的变化趋势反映了机体代谢变化，SLE发病或药物干预都可能会引起正常代谢图谱的改变。对照组和SLE模型组的PLS-DA分析，鉴定出10个SLE的代谢标记物(Tab1)，分析这些代谢标记物在给药前后相对含量的变化(Fig4)，发现在SLE模型组中代谢标记物含量与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，说明SLE对小鼠血清中代谢物含量有较大的影响。

Fig.4 Charts of different metabolite peak area *P＜0.05，**P＜0.01 vs SLE model

图选项

青蒿-鳖甲药对治疗组小鼠代谢标记物中，血小板活化因子(Lyso-PAF C-16，enantio-PAF C-16)、L-α-溶血卵磷脂(L-α-Lyso phosphatidylcholine)、G9a/GLP组蛋白甲基转移酶抑制剂(UNC0638)、L-丁酰基肉碱(Butyryl-L-carnitine，C4)、前列腺素B3(PGB3)和乙烷磺酸[(Z)-2-tetracos-15-enamido ethanesulfonic acid]较SLE模型组含量差异有显著性(P<0.05)，代谢标记物含量回调作用明显。这些代谢标记物含量的回调，体现了青蒿-鳖甲药对配伍对SLE模型小鼠疾病代谢的调节作用。

正常组小鼠、模型狼疮鼠及给药组狼疮鼠的血清经过PCA和PLS-DA分析，结合图谱表明，与模型组相比，青蒿-鳖甲治疗组可以降低狼疮鼠体内L-α-溶血卵磷脂(溶血磷脂1，LPC)的含量。溶血磷脂是磷脂的降解产物，由于最常用的磷脂为卵磷脂，因而溶血磷脂一般是指LPC，其具有高度细胞毒性，可破坏细胞膜的磷脂层。体内卵磷脂代谢产生LPC的过程由磷脂酶A1和磷脂酶A2催化。磷脂酶A2可催化甘油磷脂的第2位酯键断裂，生成溶血磷脂1，即L-α-溶血卵磷脂。磷脂酶A2参与自身免疫病的病理损伤过程，它又与自由基的产生密切相关。有研究表明，SLE 患者体内磷脂酶A2活性较正常人升高，且活动期较非活动期增高，可能的机制为磷脂酶A2水解膜磷脂产生的LPC及其代谢产物，产生多器官损害^{[9, 10]}。本研究结果显示，模型组血清中LPC含量较正常组明显升高，结合以上观点，可以判断与SLE疾病的发展有密切关系，青蒿-鳖甲治疗组干预后LPC水平明显下调，说明该药对的干预可以减弱LPC对细胞的毒性作用和对器官的损害，有助于SLE疾病的缓解和治疗。

补体系统是机体免疫应答过程中的一个重要的效应系统，具有溶病毒、溶细胞、溶菌等免疫调节作用，并有清除免疫复合物以及炎症介质作用。C4是补体经典激活途径的一个重要组分。补体的各组分在不同激活物的作用下，可循经典途径或替代途径被顺序活化，参与机体的特异性和非特异性效应机制；同时，补体活化也可能导致对机体组织的损伤。研究发现，补体异常与SLE疾病的发生发展有密切的关系。无论临床观察还是动物实验均证实，补体成分在SLE发病中的作用具有双重性，一方面补体蛋白缺陷或水平低下个体易患SLE，补体的存在对抵抗SLE的发生提供一定的保护作用；另一方面，补体活化的直接作用和对免疫细胞功能的影响可加重SLE的病理损害，影响SLE病程的发展和临床表现^[11]。本研究结果表明，模型组小鼠C4表达水平升高，C4含量升高常见于风湿热的急性期。经典理论认为，自身抗原和抗体结合形成免疫复合物，进而激活补体，造成炎症反应和组织损伤。提示可能与狼疮鼠急性期炎症相关，而青蒿-鳖甲治疗组尤其是高剂量组明显降低了C4的含量，提示青蒿鳖甲药对可以改善SLE小鼠急性期的炎症反应，减少其病理损害。该结果进一步证实了我们前期的研究成果^[6]，发现青蒿-鳖甲药对能抑制小鼠血清中炎性因子IL-6 的分泌，明显降低血清中IFN-γ 的水平，从而减少了因自身免疫复合物的分泌而造成的病理性损害^[12]。

血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)主要由中性粒细胞、血小板和巨噬细胞等产生，是具有广泛生物活性的磷脂类递质，参与人体多种生理、病理过程。PAF需和PAF受体结合才能产生生物活性。SLE患者经常合并动、静脉血栓形成，是血栓栓塞性疾病的高危因素。2009年，美国研究1 930例SLE病例的结果显示，22%的SLE患者合并动、静脉血栓。SLE发生血栓性疾病的危险性是其它风湿性疾病的9.6倍^{[13, 14]}。临床和实验证实，血栓形成的病理过程会伴有不同程度的血小板活化，活化的血小板释放出许多生物活性物质，这些活性物质可以使SLE 体内的免疫复合物沉积于小血管内膜、肾小球基底膜、关节等部位，激活补体引起炎症等^[13]。且有报道研究发现，PAF水平与SLE疾病活动性指数相关,可作为评估SLE 病情活动性的指标之一^[15]。本研究结果发现，高剂量药物治疗组可以明显降低Lyso-PAF C-16和enantio-PAF C-16的水平，因此推测青蒿-鳖甲干预后可以抑制PAF的活化，从而影响SLE血栓的发生发展。

由必需脂肪合成而来的前列腺素，可以使细胞对激素变得敏感。必需脂肪的缺乏，或者将必需脂肪转换成前列腺素的营养素(如维生素B3、维生素C和生物素等)的缺乏，都会造成与激素失调相关的症状。狼疮鼠模型组前列腺素B3(PGB3)与正常对照组相比明显降低，但药物组干预后PGB3水平明显升高，恢复正常，提示青蒿-鳖甲可以改善SLE引起的激素水平紊乱的状况。

综上所述，通过运用代谢组学技术鉴定疾病及用药后狼疮鼠血清差异代谢物，发现青蒿-鳖甲药对配伍作用后影响了体内一些疾病相关代谢物，尤其是脂质代谢和免疫相关因子，推测其可能为药物作用的关键靶点，为治疗SLE疾病复方的开发和进一步研究奠定了理论基础。

(致谢:本文实验在浙江中医药大学基础医学院中医临床基础研究所完成，在整个研究完成过程中得到了温成平教授、丁兴红教授、孔宏伟副研究员及谢志军副研究员的悉心指导和热忱帮助，在此深表谢意！)