2.扬州大学 天然药物研究室,江苏 扬州 225001
2. Institute of Natural Drug Research,Yangzhou University,Yangzhou Jiangsu 225001,China
板蓝根(Indigotica Fort)别名靛青根、蓝靛根、靛根,为十字花科植物菘蓝(Isatis Indigotica Fort)的干燥根,是中国传统中药,始载于《神农本草经》,性寒味苦,有清热解毒、凉血消肿的功效[1]。随着国际上应用天然药物的增多,板蓝根的有效成分及其药理活性得到了深入研究[2]。板蓝根活性组分(ACRI)是从板蓝根中提取分离获得的活性多糖。目前,已有文献报道从植物原料中分离得到的多种多糖具有耐缺氧及抗疲劳的药理活性,如五味子多糖、枸杞多糖、黄芪多糖、四叶参多糖、淫羊藿多糖等[3, 4, 5, 6, 7]。本实验拟研究ACRI对小鼠耐疲劳及抗疲劳的作用,以期为研制ACRI提供科学的实验依据。
1 材料 1.1 动物清洁级ICR小鼠,体质量为18~22 g,由扬州大学比较医学实验中心提供,生产许可证号SCXK(苏)2002-0009,使用许可证号SYXK(苏)2002-0045。
1.2 药物与试剂ACRI,由扬州大学药物研究所中药及天然药物研究室提供,多糖含量在80%以上,原药材产地:江苏省连云港市灌南;西洋参口服液(桂林安和药业有限公司);钠石灰(上海五四化学试剂有限公司);超氧化歧化酶、丙二醛、尿素氮、乳酸和肝糖元试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.3 仪器游泳箱(50 cm×50 cm×40 cm);DS-671电子秤(上海寺冈电子有限公司),JPT-5型架盘天平(江苏常熟衡器厂),722型分光光度计(上海精密仪器有限公司),TDL-5型离心机(上海安亭科学仪器厂),W201B型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司),铅皮;手术器械等。
2 方法 2.1 实验动物分组与给药方法将小鼠随机分为5组,分别为空白对照组、阳性药对照组(西洋参口服3 mL·kg-1)和ACRI 25、50、100 mg·kg-1 3个剂量组。采用灌胃法,给予小鼠不同剂量的受试物,空白对照组给予等量蒸馏水,阳性对照组给予等量的西洋参口服液。每天给药1次,连续14 d。
2.2 小鼠常压耐缺氧实验小鼠50只,♀♂各半,随机分为5组。最后1次给药后分别将小鼠放入盛有10 g钠石灰的容量为250 mL磨口瓶内,加上盖子密封。观察其存活时间,以呼吸停止为死亡指标。
2.3 小鼠负重游泳实验小鼠50只,♀♂各半,随机分为5组。最后1次给药后称重,计算小鼠给药前后的体重增长率,次日分别将小鼠置游泳箱中游泳。水深不少于30 cm,水温(25±1.0) ℃,鼠尾根部负荷5%体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间,作为小鼠游泳时间。以小鼠沉到水中未再有张口呼吸判断为死亡指标。
2.4 SOD、MDA和肝糖原测定小鼠50只,♂,根据体重随机分为5组。末次给药30 min后,眼球取血,分离血清,检测血清SOD、MDA,处死小鼠后迅速取出肝脏,制备肝组织匀浆,按试剂盒说明书测定肝脏SOD、MDA及肝糖原。
2.5 血清尿素氮测定小鼠50只,♂,根据体重随机分为5组。末次给药30 min后,在水深不少于30 cm,水温(25±1.0)℃水中游泳90 min。运动后安静60 min,摘眼球取血,并分离血清,按试剂盒说明书操作,测定血清尿素氮含量。
2.6 血乳酸测定小鼠50只,♂,根据体重随机分为5组。末次给药30 min后,用毛细玻璃管眼眶采血20 μL,然后让小鼠在温度为30℃的水中不负重游泳10 min,休息20 min后,再采血20 μL,检测游泳前后的血乳酸含量。
2.7 统计学处理实验数据均以x±s表示,应用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析,比较组间差异性。
3 结果 3.1 ACRI对小鼠体重的影响如Tab1所示,3个剂量组的ACRI均可明显抑制小鼠体重的增长,降低增长率,呈剂量依赖性(P<0.01)。西洋参口服液对小鼠体重增长没有明显影响。
Group | Before drugadministration/g | Afteradministration/g | Weight growthrate/% |
Control | 21.80±1.32 | 25.60±2.32 | 17.29±5.01 |
ACRI 25 mg·kg-1 | 21.70±2.00 | 23.60±2.17 | 8.80±2.55** |
ACRI 50 mg·kg-1 | 21.80±1.32 | 23.40±1.58* | 7.32±2.29** |
ACRI 100 mg·kg-1 | 21.20±1.48 | 22.10±1.45** | 4.28±1.54** |
Ginseng 3 mL·kg-1 | 21.50±2.22 | 25.80±3.12 | 19.95±6.60 |
*P<0.05,**P<0.01 vs normal control |
如Tab2所示,ACRI 25、50 mg·kg-1剂量组可明显延长小鼠常压耐缺氧的存活时间,与空白组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。ACRI 100 mg·kg-1剂量组并不能明显延长小鼠常压耐缺氧的存活时间,西洋参口服液对小鼠常压耐缺氧的存活时间也没有明显的影响(P>0.05)。
Group | Hypoxia tolerance time/min |
Control | 42.95±8.12 |
ACRI 25 mg·kg-1 | 67.76±15.02** |
ACRI 50 mg·kg-1 | 53.29±12.53* |
ACRI 100 mg·kg-1 | 49.04±9.19 |
Ginseng 3 mL·kg-1 | 44.18±10.50 |
*P<0.05,**P<0.01 vs normal control |
如Tab3所示,ACRI 25、50 mg·kg-1剂量组及西洋参口服液组明显延长小鼠负重游泳时间,与空白对照组比较具有明显差异,尤其是ACRI 25 mg·kg-1效果更加明显,而ACRI 100 mg·kg-1剂量组对此无明显影响。
Group | Load swimming time/min |
Control | 94.32±8.60 |
ACRI 25 mg·kg-1 | 172.13±15.05** |
ACRI 50 mg·kg-1 | 105.89±9.95* |
ACRI 100 mg·kg-1 | 88.67±8.97 |
Ginseng 3 mL·kg-1 | 151.72±11.16** |
*P<0.05,**P<0.01 vs normal control |
如Tab4所示,与空白组比较,ACRI 25、50 mg·kg-1剂量组及西洋参口服液组能够明显增强小鼠血清和肝脏SOD活性(P<0.01)。ACRI 100 mg·kg-1剂量组与空白组比较,血清和肝脏SOD活性虽有所提高,但差异无显著性(P>0.05)。
Group | Serum SOD/kU·L-1 | Liver SOD/kU·g-1 Pro |
Control | 288.95±60.19 | 263.62±52.06 |
ACRI 25 mg·kg-1 | 505.87±35.96** | 492.87±55.30** |
ACRI 50 mg·kg-1 | 410.22±49.65** | 427.72±42.85** |
ACRI 100 mg·kg-1 | 318.44±48.49 | 345.44±58.78 |
Ginseng 3 mL·kg-1 | 451.92±36.14** | 436.33±67.04** |
**P<0.01 vs normal control |
如Tab5所示,与空白组比较,ACRI 25、50 mg·kg-1剂量组及西洋参口服液组小鼠血清及肝脏MDA含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。ACRI 100 mg·kg-1剂量组血清和肝脏MDA含量与空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
Group | Serum MDA/μmol·L-1 | Liver MDA/μmol·g-1 Pro |
Control | 68.97±12.70 | 74.39±18.06 |
ACRI 25 mg·kg-1 | 30.22±9.76** | 42.51±13.19** |
ACRI 50 mg·kg-1 | 38.78±11.77** | 51.02±10.28** |
ACRI 100 mg·kg-1 | 49.87±13.81 | 63.76±12.22 |
Ginseng 3 mL·kg-1 | 37.76±10.85** | 54.33±9.81* |
*P<0.05,**P<0.01 vs normal control |
如Tab6所示,ACRI 25、50 mg·kg-1剂量组和西洋参口服液组可明显升高小鼠肝糖原含量,与空白组比较差异有显著性(P<0.05),而ACRI 100 mg·kg-1剂量组对小鼠肝糖原含量无明显影响(P>0.05)。
Group | Content of liver glycogen/mg·g-1 |
Control | 3.44±1.01 |
ACRI 25 mg·kg-1 | 5.08±1.25* |
ACRI 50 mg·kg-1 | 4.84±1.12* |
ACRI 100 mg·kg-1 | 4.55±1.09 |
Ginseng 3 mL·kg-1 | 4.88±1.16* |
*P<0.05 vs normal control |
如Tab7所示,ACRI 25、50 mg·kg-1剂量组和西洋参口服液组可明显降低小鼠游泳后血清尿素氮的含量,与空白组比较差异有显著性(P<0.05),而ACRI 100 mg·kg-1剂量组并不能明显降低小鼠血尿素氮的含量(P>0.05)。
Group | Serum urea nitrogen/mmol·L-1 |
Control | 10.39±1.47 |
ACRI 25 mg·kg-1 | 8.89±1.38* |
ACRI 50 mg·kg-1 | 8.53±1.68* |
ACRI 100 mg·kg-1 | 8.98±1.99 |
Ginseng 3 mL·kg-1 | 8.51±2.03* |
*P<0.05 vs normal control |
如Tab8所示,游泳前各组小鼠血乳酸与空白组比较差异无显著性(P>0.05)。游泳后,ACRI 25、50 mg·kg-1剂量组和西洋参口服液组小鼠血清乳酸含量与空白组比较明显降低(P<0.01或P<0.05)。
Group | Before swimming/mmol·L-1 | After swimming/mmol·L-1 |
Control | 7.02±1.21 | 6.04±1.19 |
ACRI 25 mg·kg-1 | 6.92±1.59 | 4.06±1.07** |
ACRI 50 mg·kg-1 | 7.06±1.16 | 5.40±0.99* |
ACRI 100 mg·kg-1 | 7.10±1.15 | 5.68±1.09 |
Ginseng 3 mL·kg-1 | 7.04±1.11 | 5.28±1.11* |
*P<0.05,**P<0.01 vs normal control |
常压缺氧实验和负重游泳实验可以反映在环境供氧缺乏和自身耗氧量增加的情况下,机体的耐缺氧和抗疲劳的能力,常被用于研究药物的耐缺氧和抗疲劳作用。本实验结果显示,ACRI能明显延长小鼠在常压缺氧状态下的存活时间和小鼠负重游泳时间,说明ACRI具有增强小鼠耐缺氧和抗疲劳的能力。
缺氧和疲劳是机体受到紧张性刺激后产生的一种应激性反应。机体缺氧可影响机体的各种新陈代谢,引起一系列的功能和形态结构的变化,特别是影响机体的氧化功能。机体内一系列氧自由基代谢会发生改变,表现为抗氧化能力下降和脂质过氧化反应增强。严重缺氧后会导致心脑等重要器官的损伤,引起死亡[8]。
机体疲劳时,主要表现为:① 氧自由基增多。SOD是机体清除氧自由基的重要酶,可以直接反映机体抗氧化水平。MDA是自由基引起的脂质过氧化的主要产物,MDA含量可以间接反映机体抗氧化能力及清除氧化产物的能力[9]。② 糖原储备量降低。机体剧烈运动时,肌糖原耗竭增加,为维持血糖水平,肝糖原储备量也减少。体内的糖原是运动能量的来源,糖原的含量能说明疲劳发生的快慢或程度,糖原储备充足,供应的能量就多,抗疲劳能力就强。③ 糖酵解产物乳酸堆积。乳酸是糖酵解的主要代谢产物,机体剧烈运动时,细胞相对缺氧,糖酵解加快,产生大量乳酸,肌肉中H+浓度上升,引起疲劳。乳酸在体内的积累取决于乳酸的产生与消除速度。小鼠游泳前后血浆中乳酸含量的变化可以作为评价疲劳的指标。④ 血液中尿素氮水平升高。机体剧烈运动时,蛋白质及氨基酸的分解代谢增强,氨基酸会代谢转化生成尿素进入血液,血尿素氮含量增加,血尿素氮也是疲劳时肌肉酸痛的主要原因。因此,血尿素氮水平的高低是判断机体疲劳程度的重要指标[10]:运动后血尿素氮清除越快,则疲劳消除得越快,抗疲劳的效果亦越明显。
本实验结果显示,ACRI各剂量组均可明显抑制小鼠体重的增长;ACRI能够增强小鼠血清和肝脏SOD活性,降低MDA含量,增强了清除机体运动时产生自由基的能力;提高肝糖原储备量;降低小鼠游泳后血尿素氮和血乳酸水平。提示ACRI耐缺氧和抗疲劳的作用机制可能与以下两点有关:明显提高体内抗氧化系统酶活力,增强体内抗氧化防护能力,清除体内氧自由基,防止细胞膜脂质过氧化,有效预防细胞自由基损伤;提高机体糖原储备,增强小鼠运动耐力及降低运动时血乳酸的堆积,加快消除疲劳。
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