2.河北北方学院 临床医学专业2013级学生;
3.河北北方学院 医学影像专业2012级学生;
4.河北北方学院 生命科学研究中心,河北 张家口 075000
2. Major of Clinical Medicine,Grade 2013;
3. Major of Medical Image,Grade 2012;
4. Life Science Research Center,Hebei North University,Zhangjiakou Hebei 075000,China
青蒿素作为抗疟药之一，是从植物青蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物。我国著名科学家屠呦呦也因此获得诺贝尔生理学或医学奖，并在颁奖礼上告诉全世界“青蒿素是传统中医给世界的礼物”。而青蒿琥酯(artesunate,ART)作为青蒿素的衍生物之一，已在临床普遍应用于抗疟治疗，其药理作用较为安全稳定。国内外报道青蒿琥酯对多种肿瘤细胞有抑制作用，但对结肠癌细胞的抑制作用机制尚未明确[1]。而阻断结肠癌细胞内Wnt/β-catenin信号通路的活化，能抑制结肠癌细胞的增殖并诱导凋亡[2]。对于青蒿琥酯诱导结肠癌细胞凋亡是否通过Wnt/β-catenin信号通路，目前尚不明确。本研究将针对细胞内Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin、GSK-3β、TCF4/LEF及靶基因c-Myc为研究方向，探索青蒿琥酯诱导结肠癌细胞凋亡的影响机制。
1 材料与方法 1.1 试剂与细胞培养人结肠癌细胞Lovo购自中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院细胞资源中心。青蒿琥酯购自桂林南药股份有限公司(批号H10930195)。Annexin V/PI凋亡试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，蛋白提取和BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所，所有抗体和ECL发光试剂盒均购自Santa Cruz Biotechnology公司，荧光素酶报告基因试剂盒购自New England Biolabs(Beijing)公司。Lovo细胞培养于含10%胎牛血清的F12K培养基(购自Sigma Aldrich公司)，在5% CO2、37℃温箱中培养。
1.2 实验设计及分组分为对照组和实验组。实验组用ART处理，设立20、40、80、160、240、320 μmol·L-1 6个浓度梯度；对照组的处理是相同体积的DMSO。
1.3 MTT法评估细胞增殖将细胞按1×104密度种于96孔板，用不同浓度ART(20、40、80、160、240、320 μmol·L-1)处理，每个浓度设4个复孔，分别处理24、48、72 h后，加入MTT染液，4 h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL，温箱放置15 min，用酶标仪检测570 nm波长处的OD值。细胞增殖抑制率/%=(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100%。
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡处于对数生长期的细胞待贴壁后，按实验设计加入不同浓度ART(20、80、160 μmol·L-1)，24 h后收集细胞，先用预冷PBS清洗2遍，然后分别滴加Annexin-V FITC和PI处理细胞(按试剂盒说明进行)，最后通过流式细胞仪进行凋亡检测。
1.5 透射电镜观察细胞形态及凋亡情况将不同浓度药物作用细胞48 h，PBS冲洗后，用2.5%戊二醛、1%锇酸固定细胞，常规制作透射电镜样本，观察各组细胞器的超微结构变化。
1.6 荧光素酶报告质粒检测Wnt通路信号转导的变化将处于对数生长状态的细胞铺于T25培养瓶中，待细胞贴壁后，用Lipofectamine转染LEF/TCF4报告质粒(pTOP-Luc)3 μg，4 h后换液。12 h后将细胞消化并重新种于24孔板中，待细胞贴壁后，按实验设计加入不同浓度ART(20、80、160 μmol·L-1)进行处理。24 h后，裂解细胞，收集裂解液，并按试剂盒操作说明进行荧光素酶活性测定。用BCA法测定总蛋白浓度，每组实验重复3次，结果取平均值。
1.7 Western blot法检测凋亡相关蛋白及Wnt通路关键蛋白的表达将对数生长期的细胞按实验设计加入不同浓度ART(20、80、160 μmol·L-1)进行处理，药物作用48 h后，提取各组蛋白。采用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜、封闭、孵育一抗、二抗、洗膜、显影、定影、成像，上机检测，每组实验重复3次。
1.8 统计学方法结果以x±s表示，运用SPSS 13.0统计软件进行组间多因素比较，采用重复测量设计的方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法；同时采用单因素非参数检验。
2 结果 2.1 ART对Lovo细胞增殖的影响经20、40、80、160、240、320 μmol·L-1青蒿琥酯处理Lovo细胞24、48、72 h后增殖抑制率比较，不同浓度间存在差别(F=464.922，P=0.000)，两两比较采用Bonferroni法，240、320 μmol·L-1组差异没有统计学意义(P=0.191)，其余任两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；不同时相的抑制率也存在差别(F=543.781，P=0.000)；不同浓度与不同时间的抑制率差异有统计学意义(F=10.675，P=0.000)，说明在不同浓度下不同时间变化的趋势不同，提示ART能抑制Lovo细胞增殖，并在一定范围内呈时间和剂量依赖性(Fig1)。
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| Fig.1 Proliferation inhibitory effect of artesunate on Lovo cells |
用ART按不同浓度(20、80、160 μmol·L-1)处理Lovo细胞24 h后，流式细胞分析结果显示，细胞早期凋亡率随药物浓度增加而增加(Fig2A)；电镜结果显示，药物处理组Lovo细胞染色质浓缩于核膜下，呈新月形、胞质空泡化，甚至出现凋亡小体等凋亡特征，提示ART能促进Lovo细胞凋亡(Fig2B)。
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| Fig.2 Effects of artesunate on apoptosis in Lovo cells Lovo cells were treated with different concentrations of ART for 24 h,followed by flow cytometry analysis or electron microscopy for apoptosis assay. A: Flow cytometry analysis results; B: Electron microscopy results(×5 000) |
与阴性对照组(1.00±0.00)比较，20、80、160 μmol·L-1青蒿琥酯组TCF4/LEF活性(0.75±0.26)%、(0.53±0.15)%、(0.36±0.30)%，呈逐渐降低的趋势，且差异有统计学意义 (F=470.954，P＜0.01)。青蒿琥酯可明显抑制TCF4/LEF报告质粒的转录活性，且随药物浓度升高，其抑制作用也依赖性增加，表明青蒿琥酯可明显抑制Wnt/β-catenin通路的信号转导。
2.4 ART对凋亡关键蛋白caspase-3及通路相关蛋白表达的影响Western blot结果显示，ART(20、80、160 μmol·L-1)作用48 h后，与阴性对照组比较，caspase-3由(0.63±0.07)上调至(1.07±0.04)(F=178.884，P<0.01)，GSK-3β(0.72±0.02)上调至(1.29±0.02)(F=674.568，P<0.01)，而β-catenin由(0.90±0.06)下调至(0.44±0.04)(F=89.619，P<0.01)，c-Myc由(0.64±0.12)下调至(0.35±0.02)(F=57.240，P<0.01)(Fig3)。提示ART诱导细胞凋亡可能与抑制Lovo细胞Wnt/β-catenin通路有关。
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| Fig.3 Effects of artesunate on different kinds of proteins in Lovo cells after 48 h |
结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，2012年全球约有14万结肠癌新发病例，占所有恶性肿瘤的10%[3]，死亡率占世界恶性肿瘤第4位[4]。虽然目前对结肠癌的诊断和治疗技术有了较大提高，但结肠癌的预后仍不容乐观。而传统植物来源的药物在治疗各种肿瘤中发挥着重要作用[5]。
青蒿素(artmisinin) 是我国科学家屠呦呦在1971年首次从菊科植物黄花蒿(Aremisia annua Linn)提取的新型结构的倍半萜内酯化合物。它不仅是一种高效、低毒的抗疟药物，同时也具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等应用价值[6]。ART是青蒿素的衍生物之一，已有报道ART等青蒿素衍生物能对70余种肿瘤细胞有抑制作用[7, 8]。结合ART毒副作用低、不产生交叉耐药等特点，与其他化疗药物联合应用，有望在肿瘤治疗中提高化疗药物的疗效[9]。本研究表明，ART对人Lovo细胞的增殖有明显抑制作用，且能诱导Lovo细胞早期凋亡，电镜结果显示经ART处理48 h后的Lovo细胞呈现细胞凋亡典型变化，而诱导凋亡可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
Wnt/β-catenin信号通路关键的正性调控因子是β-catenin(β-cat)，在生理状态下主要在细胞膜上表达，介导同型细胞之间的黏连。磷酸化肌醇3激酶β(glycogen synthase 3 kinase-β,GSK3β)是Wnt信号通路的重要负性调控因子，与胞质内Axin、APC等结合成“破坏复合体”(destruction complex)，与β-cat结合，并促进其磷酸化，使β-cat很快被蛋白酶体降解，维持细胞内β-cat的低水平状态。肿瘤细胞内Wnt信号通路被异常激活，致β-cat不能及时降解，而由胞膜向胞质、胞核转移，激活下游靶基因c-Myc、Cyclin D1、MMP-7等，促进肿瘤的发生发展[10, 11]。有研究发现，双氢青蒿素可通过Wnt信号通路抑制骨肉瘤细胞系体外增殖和迁移[12]，青蒿琥酯可通过Wnt信号通路抑制卵巢癌细胞的侵袭[13]，也能抑制结肠癌细胞的生长[14]，但影响机制尚需探讨。
目前β-cat成为治疗结肠癌药物的重要靶点之一[15]，对Wnt信号通路的研究也多集中于β-cat的积累和入核，对下游转录因子TCF/LEF知之甚少。而TCF/LEF在Wnt/β-cat信号通路中起着分子开关的作用，β-cat进入细胞核后，与TCF/LEF结合形成复合物，调节下游靶基因的表达。许多肿瘤的发生发展与 TCF/LEF 家族密切相关[16, 17, 18]。研究发现，在核内转录因子TCF/LEF未激活的情况下，APC基因可以激活半胱氨酸家族成员，如caspase-3，然后清除多聚合酶,使得细胞发生破碎，从而引起细胞凋亡。Jeong等[19]研究发现,TCF4在人多种大肠癌细胞中高表达，而正常细胞表达很低，通过药物诱导TCF4低表达，可以抑制β-cat/TCF4转录活性，促进大肠癌细胞的凋亡。周密等[20]用荧光素酶报告质粒法，研究Lovo细胞中TCF4/LEF与靶基因c-Myc/Max的转录活性降低来说明药物美洛昔康能明显下调细胞Wnt/β-cat通路的信号转导。本实验结果显示，ART能明显抑制 TCF4/LEF报告质粒的转录活性。Western blot研究发现，随着ART浓度的升高，GSK-3β表达上调，而β-cat和c-Myc表达下调，这可能是通过GSK-3β催化活性增强，诱导破坏复合体Axin-APC-GSK-3β形成，促进β-cat降解，减少向胞核内转移，抑制TCF4/LEF报告质粒的转录活性，一方面使下游靶基因c-Myc的表达减弱；另一方面能促进凋亡关键蛋白caspase-3表达，诱导结肠癌细胞凋亡。
总之，本实验研究发现,青蒿琥酯能够抑制结肠癌细胞的增殖、诱导其凋亡，可能通过上调GSK-3β，下调β-catenin和c-Myc，抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。通过体外研究我们还发现，ART能抑制结肠癌细胞侵袭和转移[21]，下一步我们将进行体内实验，建立结肠癌动物模型，进一步研究ART抑制结肠癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移的分子机制。
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