是肝纤维化发生发展的中心环节，抑制HSC活化增殖是防治肝纤维化的重要措施之一^[1]。研究证实^{[2, 3]}，抑制瞬时感受器电位M7，可抑制人胚肺成纤维细胞株(MRC-5)、大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)活化增殖，促进其凋亡。提示离子通道蛋白可影响HSC增殖活化，可能在肝纤维化进程中发挥作用。HSC 细胞膜上的离子通道成为调控HSC增殖与凋亡的新靶点。

瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels,TRP channels)是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道，TRPV为TRP家族中的一个亚家族，TRPV广泛存在于人体各种组织中，如心脏、肝、脾、肾、大脑、子宫等，参与人体的生理功能和病理变化。瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4(transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)属TRPV家族成员，TRPV4不仅参与炎症和神经性疼痛的痛觉调控，还能感知热知觉，并且可调节细胞的生长死亡等生理作用，具有重要的临床和药理学研究价值^[4]。TRPV4在肝纤维化中的作用及可能的作用机制还不明确。本研究通过在体、离体观察TRPV4在肝纤维化组织及活化的HSC中的表达变化，通过阻断、沉默TRPV4，观察其对HSC活化增殖的影响，及对蛋白激酶B(protein kinase B,Akt/PKB)蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制。

♂ Spague-Dawlay(SD)大鼠，体质量180~220 g，由安徽医科大学动物中心提供。动物自由饮食，饮用自来水，喂养标准颗粒饲料，室温(18~26) ℃，常规饲养观察1周后使用。

HSC-T6细胞株购于上海中科院细胞库。以DMEM高糖培养基(内含10%胎牛血清、100 kU·L^-1青霉素、100 mg·L^-1链霉素)，在37℃含5% CO₂恒温培养箱孵育。实验取对数生长期细胞。

CCl₄，汕头西陇化工厂，临用前用花生油1 ∶1稀释；钌红(ruthenium red,Ru)，Sigma公司产品；重组人转化生长因子(recombinant human TGF-β1)，PeproTech公司产品；透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)，北京北方生物技术研究所；羟脯氨酸(Hyp)，南京建成生物工程研究所；MTT(3,4,5-dimethylthiazo-2-yl-2,5- diphenyltetrazolium bromide)粉，美国Sigma公司，用PBS配制成5 g·L^-1，过滤除菌，4 ℃避光保存；TRIzol Reagent试剂，Invitrogen Life Technology公司；Reverse Transcription System逆转录试剂盒、PCR试剂盒，Fermentas公司产品；抗TRPV4抗体，美国Abcam公司产品；抗β-actin抗体、抗Akt抗体，Santa Cruz 公司产品；抗α-SMA抗体，博士德公司产品；辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物技术公司产品。

大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组、模型组，每组10 只。CCl₄(分析纯)与花生油1 ∶1配制成植物油溶液，模型组于大鼠背部皮下注射含50% CCl₄的花生油1 mL·kg^-1，每周2次，连续12周。正常组注射花生油1 mL·kg^-1。12周末，大鼠禁食8 h处死，取血及肝脏组织，检测HA、LN、CⅣ、Hyp、病理及α-SMA、Akt、TRPV4蛋白表达情况。

按试剂盒说明书要求规范操作，测定血清HA、LN、CⅣ含量以及肝组织匀浆Hyp含量。

取肝左叶相同部位的肝脏组织，大小为 5 mm×5 mm，置于4％多聚甲醛中固定24 h。样品经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，用石蜡包埋，制备5 μm连续切片后，HE、Masson 染色切片，光镜下观察肝脏组织形态学变化情况。

0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的HSC-T6 细胞，接种于96 孔板中，每孔1× 10⁴个细胞，培养液体积为200 μL，培养细胞密度至80%~90%进行实验。实验组加入1 μmol·L^-1的Ru，对照组加入等体积的DMEM，每组设5个平行孔，37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。培养结束前4 h，每孔加入20 μL浓度为5 g·L^-1的 MTT，吸去上清液，加入DMSO，每孔200 μL，混匀10 min后，酶标仪570 nm处测定各孔吸光度A值。对照组细胞存活率为100%，其余各组按：存活率/%=[(各实验组吸光度值-本底吸光度值)/(对照组吸光度-本底吸光度值)]×100%，实验重复3次。

靶向目的基因TRPV4的序列设计正义链：5′-CCGUGUCCUUCUACAUCAATT-3′，反义链：5′-UUGAUGUAGAAGGACACGGTT-3′；阴性对照组正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。应用BLAST 检索GenBank表达序列标签(EST)数据库，确定siRNA序列唯一性，上海吉玛制药有限公司合成。实验分正常组、模型组、对照组和TRPV4-siRNA 转染组。细胞传代至6 孔培养板，培养液体积为2 mL，每孔2×10⁵个细胞，模型组加入20 μL浓度为1 mg·L^-1的TGF-β1，使其终浓度为10 μg·L^-1，对照组转染scrambled-RNAi并加入相同量的TGF-β1，转染组转染TRPV4-siRNA并加入相同量的TGF-β1。以Opti-MEM 和脂质体转染，脂质体与siRNA量均为5 μL，siRNA 终浓度为100 pmol·L^-1，置于 37℃、5% CO₂培养箱转染6 h后，正常组加入完全培养基，其余每组加入含TGF-β1的完全培养基，继续培养48 h，收获细胞，实验重复3次。

提取组织、细胞总蛋白，进行12% SDS-PAGE电泳，0.45 μm PVDF膜转移，一抗4 ℃孵育过夜，再与辣根过氧化物酶偶联二抗室温孵育1 h，ECL 显色。成像结果应用Image J 软件分析，通过分析α-SMA、TRPV4、p-Akt、Akt、β-actin的灰度值，计算各蛋白的含量变化是否具有统计学意义，实验重复3次。

采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，数据以x±s表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

以CCl₄诱导大鼠肝纤维化，观察血清HA、LN、CⅣ及肝组织匀浆中Hyp表达变化，结果发现(Tab1、Tab2)，与正常组相比，模型组血清HA、LN、CⅣ明显增加(P<0.01)，肝组织匀浆中Hyp亦明显增加(P<0.01)。 HE 染色显示(Fig1)，正常组大鼠肝细胞完整，肝组织无异常纤维增生；模型组可见肝小叶结构破坏，成纤维细胞出现，假小叶形成，肝组织中有明显炎性细胞浸润。Masson 染色结果显示，正常大鼠肝细胞完整，无纤维组织增生；模型组大鼠有较多的成纤维细胞出现，纤维结缔组织增生，肝索排列紊乱并伴有假小叶形成。提示大鼠肝纤维化模型建立成功。

Fig.1 Pathological observation of experimental rat liver sections stained with hematoxylin and eosin(HE) staining and Masson staining(×200)

图选项

进一步观察TRPV4的表达变化。Western blot 检测发现(Fig2A)，与正常组相比，模型组大鼠肝组织α-SMA、TRPV4蛋白表达明显增加(P<0.01)。进一步以TGF-β1(10 μg·L^-1)刺激HSC-T6细胞株，亦发现TGF-β1可明显促进α-SMA、TRPV4蛋白表达(Fig2B)。提示肝纤维化HSC活化增殖过程中，TRPV4表达增高。

Fig.2 Up-regulation of TRPV4 and α-SMA in CCl4-treated rats and TGF-β1-treated HSC-T6 cells A:Whole-cell extracts were isolated from the liver tissues of CCl4-treated rats or vehicle-treated group,and subjected to immunoblot for TRPV4,α-SMA and β-actin. Representative images of three independent experiments are shown. **P<0.01 vs vehicle control;B:Whole-cell extracts were isolated from TGF-β1-treated HSC-T6 cells,and subjected to Western blot analysis with TRPV4,α-SMA and β-actin antibodies. Representative blots of three independent experiments are shown. **P<0.01 vs non-treated cells.

图选项

为观察TRPV4对HSC活化增殖的影响，应用TRPV4非特异性抑制剂钌红(Ru 1 μmol·L^-1) 作用于TGF-β1刺激的HSC-T6细胞，24 h后，Western blot结果发现(Fig3A)，与TGF-β1(10 μg·L^-1)刺激的

Fig.3 Ru prevented the proliferation and activation of HSC-T6 cells in vitro A:Whole-cell protein extracts were made from HSC-T6 cells treated with or without TGF-β1 and Ru,and subjected to Western blot analysis of TRPV4. Representative images of three independent experiments are shown;B:HSC-T6 cells were seeded in triplicate on day 0 and incubated in DMEM containing 10% fetal bovine serum or same media supplemented with Ru for further 24 h. Proliferation was measured by adding 5 g·L-1 MTT reagent per well and incubating it for 4 h; C:Whole-cell protein extracts were made from HSC-T6 cells treated with or without TGF-β1 and Ru,and subjected to Western blot analysis of α-SMA. Representative images of three independent experiments are shown. *P<0.05,**P<0.01 vs TGF-β1-treated cells.

图选项

HSC-T6细胞比较，经钌红处理后，TRPV4蛋白水平明显下调，差异有统计学意义。MTT及Western blot结果亦发现，与TGF-β1(10 μg·L^-1)刺激的HSC-T6细胞比较，钌红可明显抑制TGF-β1(10 μg·L^-1)刺激的HSC-T6细胞株增殖及α-SMA的蛋白表达。提示TRPV4可能参与肝纤维化HSC活化增殖的过程(Fig3B、3C)。

为了进一步研究TRPV4对HSC活化增殖的影响，应用TRPV4-siRNA特异性沉默TRPV4。转染特异性TRPV4-siRNA 48 h后，Western blot结果发现，与阴性对照组相比，转染组TRPV4蛋白表达明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义(Fig4A)。MTT及Western blot实验结果显示，与阴性对照组相比，转染组HSC-T6细胞的增殖明显受到抑制，α-SMA蛋白水平明显下调，差异有统计学意义(Fig4B、4C)。提示TRPV4参与肝纤维化HSC活化增殖的过程。

Fig.4 TRPV4-siRNA inhibited HSC-T6 proliferation and α-SMA expression A:Whole-cell protein extracts were made from HSC-T6 cells treated with or without TGF-β1 and TRPV4 siRNA,and subjected to Western blot analysis of TRPV4. Representative images of three independent experiments are shown;B:HSC-T6 cells were seeded in triplicate on day 0 and incubated in DMEM containing 10% fetal bovine serum or same media supplemented with TRPV4 siRNA for further 24 h. Proliferation was measured by adding 5 g·L-1 MTT reagent per well and incubating it for 4 h; C:Whole-cell protein extracts were made from HSC-T6 cells treated with or without TGF-β1 and TRPV4 siRNA,and subjected to Western blot analysis of α-SMA. Representative images of three independent experiments are shown. *P<0.05,**P<0.01 vs non-treated cells; #P<0.05,##P<0.01 vs scrambled siRNA -treated cells.

图选项

研究证实，Akt通路在肝纤维化过程中发挥着重要的作用^{[5, 6]}。如Fig5所示，应用TRPV4-siRNA特异沉默TRPV4，可明显抑制p-Akt的表达，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。此结果提示TRPV4可抑制p-Akt的蛋白表达。

肝纤维化是慢性肝病共有的病理过程，其持续发展可形成肝硬化、甚至肝细胞癌。深入研究肝纤维化发病机制，可能为慢性肝病的防治提供新的思路。HSC的活化、增殖，平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达增加，合成和分泌ECM增多是肝纤维化发生、发展的中心环节^[7]。因此，抑制HSC活化、增殖和细胞外基质的形成是治疗肝纤维化的重要策略之一。TGF-β1作为TGF-β超家族中的重要成员之一，是致肝纤维化发生发展主要的细胞因子之一^[8]。本实验研究亦发现，以浓度为10 μg·L^-1的TGF-β1刺激HSC-T6细胞株，α-SMA表达明显升高；同时，MTT实验显示，TGF-β1刺激HSC-T6细胞株能明显促进HSC-T6细胞的增殖。

Di Sario等^[9]报道，选择性的Na/H⁺泵(NHE)抑制剂cariporide可明显抑制在体及离体状态下 PDGF 诱导的大鼠 HSC 增殖。实验室前期研究发现，抑制瞬时受体电位 M7 通道(transient receptor potential melastatin 7，TRPM7)可抑制MRC5、HSC-T6细胞株活化增殖，促进其凋亡，上述研究提示，离子通道功能的改变影响细胞的增殖、凋亡等生理功能^{[2, 3, 10, 11, 12]}。瞬时受体电位通道是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道，TRPV为TRP家族中的一个亚家族。研究发现，TRPV家族成员TRPV4不仅参与炎症和神经性疼痛的痛觉调控，感知热知觉，并且可调节细胞的生长、死亡等生理作用，具有重要的临床和药理学研究价值。但TRPV4在肝纤维化中的作用还不明确。我们研究发现，CCl₄诱导大鼠肝纤维化模型中，大鼠肝纤维化组织中TRPV4表达明显升高。进一步以HSC-T6为研究对象，以转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导其活化，结果亦证实，HSC中存在TRPV4的表达，并且活化的HSC中，TRPV4表达明显升高。应用TRPV4阻断剂钌红作用于HSC-T6，实验发现，钌红可明显抑制TGF-β1诱导的HSC-T6增殖，并且HSC活化的特异标志物α-SMA的蛋白表达亦明显降低。提示TRPV4可能参与了HSC活化增殖。进一步应用TRPV4-siRNA特异性沉默TRPV4，结果发现，特异性沉默TRPV4可明显抑制TGF-β1诱导的HSC-T6增殖与α-SMA的表达。上述的实验表明，TRPV4蛋白具有调控HSC活化增殖的功能。

Fig.5 TRPV4-siRNA decreased p-Akt expression Whole-cell protein extracts were made from HSC-T6 cells treated with or without TGF-β1 and TRPV4 siRNA,and subjected to Western blot analysis of Akt and p-Akt. Representative images of three independent experiments are shown. **P<0.01 vs non-treated cells; ##P<0.01 vs scrambled siRNA -treated cells.

图选项

文献及实验室前期研究发现，Akt信号通路在维持细胞存活、增殖过程中具有关键性作用^{[5, 6, 13]}，可调控HSC活化增殖。前期实验发现，TRP家族成员，TRPM7可以通过Akt通路抑制HSC增殖、促进其凋亡。作为TRP家族成员TRPV4是否调控Akt信号通路，还未见文献报道。本实验研究发现，TGF-β1诱导的HSC-T6中p-Akt表达明显升高，TRPV4-siRNA特异沉默TRPV4可明显降低p-Akt的蛋白表达，表明TRPV4调控p-Akt的蛋白表达。

综上所述，TRPV4作为阳离子通道蛋白，在HSC活化增殖过程中具有重要作用，阻断其表达可抑制HSC活化增殖。并且阻断TRPV4可抑制p-Akt蛋白表达。本实验为研究离子通道蛋白在肝纤维化中的作用提供了实验参考。