抑郁症是一种临床常见的精神障碍性疾病,以少动、思维缓慢、兴趣缺失、记忆力减退等为主要特征,严重者甚至出现自杀倾向[1]。抑郁症发病机制复杂,涉及遗传、环境、表观遗传学等众多因素。研究显示,单胺类神经递质系统功能紊乱、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能失调、脑源性神经营养因子不足、氧化应激损伤等都与抑郁症发生密切相关[2]。目前临床常用的抗抑郁药物如5-羟色胺(serotonin, 5-HT)再摄取抑制剂、去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)再摄取抑制剂等都是通过作用于单胺递质系统相应靶点,调节突触间隙递质水平而发挥治疗作用,但这类机制很难解释其药物延迟性效应。因此深入研究抑郁症发病机制,寻找药物治疗新靶点迫在眉睫。
最新研究显示,抑郁症与免疫激活和炎症因子的释放增加密切相关[3]。临床研究发现,抑郁症患者血中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ, INF-γ)、白细胞介素-1( interleukin-1 ,IL-1 )、白细胞介素-6( interleukin-6,IL-6 )水平明显增高,动物实验研究发现,腹腔注射脂多糖可诱导小鼠产生抑郁行为、TNF-α拮抗剂依那西普可明显改善小鼠的抑郁行为[4, 5, 6],提示免疫激活、炎症反应及细胞因子释放涉及抑郁症的发生发展。TNF-α是一种由多核巨细胞产生的细胞因子,具有免疫调节、介导炎症反应等功能。近年来研究发现,TNF-α在抑郁症发生中发挥着重要作用。TNF-α作为一种重要的促炎因子,可诱导IL、 INF等其他促炎细胞因子的生成和释放,引起炎症的级联放大反应。吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO)是一种细胞内的含亚铁血红素的酶,在催化色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢过程中起着限速酶的作用[7]。生理状态下,IDO呈低水平表达,但在免疫激活、炎症或感染过程中,细胞因子如TNF-α释放增多,可诱导其明显表达并过度激活,催化色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢,使合成5-HT的色氨酸耗竭,5-HT生成减少,诱发和(或)加重抑郁症[8, 9]。目前,最新临床和基础研究结果均显示,IDO过表达和(或)活性增强与抑郁症的发生密切相关,但不足以证明炎症因子、IDO与抑郁症之间的相互关系[10, 11]。同时,IDO过度激活的犬尿氨酸途径还可生成大量3-羟犬尿氨酸,并在3-羟氨苯甲酸双加氧酶(3-hydroxyl amino acid oxygenase, HAAO)的作用下代谢生成喹啉酸,3-羟犬尿氨酸和喹啉酸均具有神经毒性作用,也可能参与了抑郁症的发生[12, 13]。因此,本研究采用孤养结合CUS建立大鼠抑郁模型,观察大鼠前脑皮层和海马炎症因子TNF-α及IDO、 HAAO表达变化是否参与了抑郁症的发生。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级♂ Sprague Dawley(SD)大鼠30只,体质量180~220 g,由重庆医科大学动物中心提供,医学动物许可证号:SYXK(渝)2012-0001。
1.2 主要试剂与仪器BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技术公司);anti-TNF-α、anti-IDO、anti-HAAO抗体(英国Abcam公司);ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司);Sigma低温高速离心机:德国Sigma公司(型号:3K30);台式离心机:上海市安亭科学仪器厂(型号:TGL-16C);超低温冰箱:日本Sanyo公司;凝胶成像系统:美国Bio-Rad公司(型号:170-1870);Western blot垂直电泳仪:美国Bio-Rad公司。
1.3 方法 1.3.1 动物分组和模型建立♂ SD大鼠30只,5只/笼,自由饮水和摄食,在室温(25±1)℃、通风良好的环境下适应性喂养1周后,随机分为对照组和模型组。对照组大鼠5只/笼,自由摄食饮水,不予刺激。模型组大鼠1只/笼,采用孤养结合CUS方式建立抑郁动物模型。参照本实验室前期建模方法[14],采用的刺激方式包括4℃冰水浴5 min,45℃热水浴5 min,禁饮禁食24 h,潮湿垫料24 h,倾斜24 h,昼夜颠倒,电击5 min,噪音3 h,闪频3 h,水平振荡10 min,夹尾1 min,共11种刺激,每天随机给予1种刺激,连续刺激28 d,4 d内同种刺激不重复出现,使动物不可预知。
1.3.2 被动游泳实验(forced swim test,FST)参考文献[15]并加以改进,测试时将大鼠放入高60 cm、直径20 cm、水深30 cm的透明圆柱形玻璃缸内,维持水温(24±1) ℃。测试时间7 min,记录后5 min大鼠累计不动时间。
1.3.3 旷场实验(open-field test,OFT)参照文献[16]并加以改进,采用内壁为黑色的100 cm×100 cm×40 cm木质敞箱进行测定,木箱底部均分为25个20 cm×20 cm的方格。实验开始时将大鼠置于木箱底部中央格,观察并记录5 min内大鼠水平运动得分(四爪均进入的穿越格子数)和垂直运动得分(后肢直立次数)、理毛次数及大小便,将各项得分相加即为旷场实验得分。实验结束后,清理粪便并用酒精清洁敞箱,以免大鼠遗留气味对下次测试的影响。实验必须在安静昏暗的环境下进行。
1.3.4 皮层和海马TNF-α、IDO、HAAO蛋白表达测定末次刺激24 h后,每组取大鼠5只,4%水合氯醛麻醉后断头取脑,于冰浴上分离前脑皮层和海马并置于EP管中,-80℃保存备用。测定时,将前脑皮层和海马组织取出并剪碎、碾磨、裂解、提取蛋白,采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。采用Western blot方法检测大鼠前脑皮层和海马的的TNF-α、IDO、HAAO的蛋白表达。上样量每孔30 μg,依次进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、室温5%脱脂牛奶封闭2 h,一抗4℃孵育过夜,洗膜,二抗室温下孵育(TNF-α、IDO 1 h,HAAO 25 min),洗膜(HAAO需室温下孵育三抗35 min后再洗膜),ECL显色,凝胶成像仪成像后,用Image Lab软件(Bio-Rad)分析结果。以β-actin为内参校正蛋白表达。
1.3.5 统计学处理实验数据以±s表示,使用Graph Pad Prism 5 软件(GraphPad Software,USA)进行统计学分析。组间比较采用成对t检验。
2 结果 2.1 CUS对大鼠行为的影响被动游泳实验结果显示,与对照组大鼠相比,模型组大鼠被动游泳不动时间明显延长(P<0.01),见Fig1A。旷场实验结果显示,与对照组大鼠相比,模型组大鼠旷场实验得分明显降低(P<0.01),见Fig1B。提示CUS成功诱导大鼠产生焦虑、绝望等抑郁样行为。
2.2 CUS对大鼠前脑皮层和海马TNF-α蛋白表达的影响与对照组大鼠相比,模型组大鼠前脑皮层和海马TNF-α蛋白表达均明显增加(P<0.05),见Fig2。 提示CUS致大鼠产生抑郁行为时,炎症因子TNF-α表达明显升高。
2.3 CUS对大鼠前脑皮层和海马IDO蛋白表达的影响与对照组大鼠相比,模型组大鼠前脑皮层和海马IDO蛋白表达均明显增加(P<0.05),见Fig3。 提示CUS诱导的抑郁症大鼠脑内IDO表达明显升高。
2.4 CUS对大鼠前脑皮层和海马HAAO蛋白表达的影响与对照组大鼠相比,模型组大鼠前脑皮层和海马HAAO蛋白表达均明显增加(P<0.05),见Fig4。 提示CUS抑郁大鼠脑内HAAO表达明显升高。
3 讨论抑郁症发病机制复杂,涉及单胺递质系统功能和HPA轴功能紊乱、氧化应激损伤、神经营养因子表达下降、免疫调节异常等多种病理生理学改变,但机制尚未完全阐明。动物模型是研究抑郁症发病机制和抗抑郁药物的有效手段之一,其中CUS模型可模拟人在社会生活中遇到的各种不可预见刺激,是目前广泛采用的动物研究模型之一[17]。本研究采用CUS建立大鼠抑郁模型,研究抑郁症的其他相关发病机制。FST和OFT是评价大鼠抑郁行为的有效指标,FST通过检测大鼠在狭小环境的不动时间,反映大鼠的绝望抑郁状态;OFT通过检测大鼠在新异环境中的探究行为,反映大鼠的焦虑抑郁状态。本研究结果显示,与对照组大鼠相比,模型组大鼠被动游泳实验不动时间明显延长、旷场实验得分明显降低,提示CUS诱导大鼠出现焦虑、绝望样抑郁行为。
抑郁症的“单胺递质假说”和“细胞因子假说”都是目前比较公认的抑郁症发病机制。前者认为突触间隙的5-HT 及NE水平低下是导致抑郁症发病的重要原因;后者认为免疫激活、炎症反应及细胞因子活化和释放增多是抑郁症发病的重要原因。Maes等[8]于2011年提出新的“5-HT假说”,认为免疫激活诱导IDO活化致色氨酸耗竭、5-HT合成不足及下游毒性代谢产物增加均参与了抑郁症的发生。色氨酸是脑内合成5-HT的前体物质,主要通过两条途径进行代谢,即色氨酸-5-HT通路和色氨酸-犬尿氨酸通路。色氨酸羟化酶是脑内合成5-HT的限速酶,本实验室前期研究已证实,色氨酸羟化酶表达下调参与大鼠抑郁症的发生[18]。IDO是肝脏以外唯一可催化色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢的限速酶。生理情况下,IDO呈低水平表达,但当炎症、感染等免疫激活时,细胞因子TNF-α、IFN-γ等的释放可诱导IDO激活,催化色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢明显增多,导致合成5-HT的前体物质色氨酸耗竭,进而致5-HT合成不足,参与抑郁症的发生。Maes等[8]研究发现,抑郁症患者细胞因子分泌明显增多、IDO活性明显增强;O′Connor等[5, 6]发现,IFN-γ、TNF等炎症细胞因子可上调IDO表达诱导小鼠的抑郁样行为,而应用IDO拮抗剂1-MT可明显抑制小鼠抑郁症样行为的产生。本研究结果显示,与对照组大鼠相比,模型组大鼠前脑皮层和海马TNF-α、IDO蛋白表达均明显升高,提示CUS诱导大鼠抑郁行为与脑内免疫激活和炎症因子释放并诱导IDO激活密切相关。与此同时,犬尿氨酸途径代谢产物也可能对神经细胞产生毒性作用。在色氨酸-犬尿氨酸代谢途径中,犬尿氨酸可在犬尿氨酸羟化酶的作用下代谢为3-羟犬尿氨酸,后者在3-羟基犬尿氨酸酶作用下代谢为3-羟氨苯甲酸,最后在HAAO作用下最终代谢为喹啉酸。3-羟犬尿氨酸和喹啉酸都具有明显的神经毒性,前者可导致单胺氧化酶活性增强和氧自由基生成增多,加速单胺类神经递质的代谢并加重机体的氧化应激损伤[19];后者可作用于N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体,促进谷氨酸释放,发挥兴奋毒作用[20]。本研究结果显示,与对照组大鼠相比,模型组大鼠前脑皮层和海马HAAO蛋白表达明显升高,提示CUS诱导大鼠抑郁行为与脑内HAAO过表达密切相关。
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