2.蚌埠医学院药学系，安徽 蚌埠 233000
2. Dept of Pharmacy,Bengbu Medical College,Anhui Engineering Technology Research Center of Biochemical Pharmaceuticals,Bengbu Anhui 233000,China
1 凋亡抑制因子——IAPs家族 1.1 IAPs
IAP家族是新发现的一类在结构上具有同源性的细胞凋亡抑制蛋白，是一类高度保守的独立于Bcl-2家族的内源性抑凋亡基因家族表达产物。它们在许多物种中广泛存在，包括病毒、真核生物、哺乳动物等，具有抑制细胞凋亡的功能，与肿瘤的关系甚为密切。Roy等[1]于1995年首次从脊髓性肌萎缩症研究中发现了IAP蛋白是神经元性凋亡抑制蛋白(neuronal apoptotic inhibitor protein，NAIP)，随后人们陆续发现了细胞凋亡抑制蛋白(cellular IAP、c-IAPl和c-IAP2)、X染色体连锁凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、Survivin、黑色素瘤凋亡抑制蛋白(melanoma-IAP，ML-IAP/Livin)、睾丸特异凋亡抑制蛋白 (testis-specific IAL，Ts-IAP/hILP)和含泛素连接酶的杆状病毒IAP重复序列[2](baculoviral IAP repeat containing ubiquitin conjugating enzyme，BRUCE/apollon)等，至今已发现8个人类IAPs家族蛋白成员[3]。
目前对IAP家族蛋白的分子结构研究得较为清楚，它们一般具有3个特征性的结构区域：① BIR结构域，即杆状病毒IAP重复序列区(baculivirus IAP repeat，BIR)，其中包含3个保守的半胱氨酸和1个保守的组氨酸残基，由约70个氨基酸组成。IAP家族成员一般包含2或3个串联的BIR结构，BIR是IAP家族成员共同的分子特征，为其抑制细胞凋亡的功能区域。但只有包含BIR2功能区的IAP分子才具有抑制细胞凋亡的功能。② Ring结构，是1个位于IAP羧基端的锌指样结构单元，它们存在于大多数IAP家族成员之中，但仅仅只有XIAP和c-IAP1包含泛素蛋白连接酶活性，直接受自身泛素化和降解来调节。③ CARDs结构(caspase srecruitment domains)，位于IAPs分子的BIR区与锌指结构之间的一系列序列。至今发现，在人类中仅c-IAP1和c-IAP2蛋白具有此结构[4]，其功能尚不清楚。
1.2 XIAPXIAP是一种具有细胞凋亡抑制作用的蛋白，系人类凋亡抑制蛋白(IAPs)家族的重要成员。通过抑制凋亡信号转导途径中起核心作用的半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)分子，对细胞凋亡产生抑制作用[5]。
XIAP基因定位于Xq25，其编码的蛋白具有独特的分子结构，XIAP的抗凋亡活性就源于BIR结构域[6]。它通过BIR3、BIR2结构域分别与起始因子caspase-9和执行因子caspase-3和-7相互作用。对于不同的caspase，XIAP的作用机制不尽相同，XIAP可直接结合并抑制caspase-9、caspase-3和caspase-7等凋亡起始和效应分子[7]。这种对caspase选择性是由BIR结构域上保守氨基酸残基和BIR区间连接区Linker的特点决定的。BIR2通过结合caspase-3的底物结合位点，阻止底物进入caspase-3的催化部位，竞争性抑制caspase-3，同时由于XIAP可以抑制caspase-9，从而在上游阻止了caspase-3的激活[8]。BIRl与BIR2之间的Linker结构域抑制caspase-7。通过分析XIAP/caspase-7的晶体结构，发现Linker结构域对抑制caspase-7发挥主要作用，而BIR2只是起到使Linker产生有利于与caspase-7 结合的构象并稳定Linker/caspase-7复合体的作用。
1.3 c-IAP1/2c-IAP1和c-IAP2首先在TNFR2复合体中被发现，在所有成人组织中均可检测到。c-IAP1在胸腺、睾丸和卵巢中呈高表达，而c-IAP2却在胸腺和脾脏中呈高表达。在TNFR介导的转录因子NF-κB的激活过程中，c-IAPl和c-IAP2的表达增加，它们能降低caspase-8的活性，保护TNF诱导的细胞凋亡，然而其具体机制尚不清楚。
由于c-IAPl、c-IAP2及其它IAP家族成员都不能直接抑制caspase-8的活性，或许它们能抑制下游的caspase如caspase-3的活性，阻止其对上游caspases的正反馈调节。同时，c-IAP1、c-IAP2还能直接抑制caspase-3/7的活性。c-IAP1和c-IAP2 蛋白的BIR和RING结构域之间有1个CARD结构域(caspase recruitment domain)，可直接与肿瘤坏死因子相关因子(TRAFs)-TRAF2结合[9, 10]。通过TRAF2的作用，c-IAP1/2被整合到肿瘤坏死因子受体1和2相关的复合体中，调控受体介导的凋亡。
2 与IAPs参与凋亡有关的重要分子 2.1 caspasescaspase家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡机制网络中居中心地位。caspase是一种具有特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是一组在细胞凋亡过程中起着关键作用的酶。caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。caspase家族有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性，通常以无活性的蛋白酶原形式在细胞内合成和分泌，通过活化发生蛋白水解获得活性。酶原分子由3 部分组成，一个N端前域及一大一小两个亚基，酶原分子激活后，大小亚基解离，并重新组装为四聚体形式的活性酶[11]。caspase家族成员大多数是凋亡的启动子或效应子，在细胞凋亡过程中发挥重要作用[12, 13]。对IAPs与caspase的研究表明，IAPs主要是通过抑制caspase家族中caspase-3、caspase-7、caspase-9的活性来达到抑制细胞凋亡的作用，对caspase家族其他成员的活性基本无影响[13]。如通过caspase-8诱导的凋亡，IAPs不是直接作用于caspase-8，而是通过抑制caspase家族的核心蛋白caspase-3来发挥凋亡的抑制作用。
2.2 SmacIAP家族蛋白的抗凋亡活性可被多种内源抑制蛋白调控，如Smac/DIABLO。线粒体促凋亡蛋白(Smac，second mitochondria-derived activator of caspase )，也称为DIABLO,是Du等[14]发现的一种内源性线粒体促凋亡蛋白，参与细胞凋亡线粒体通路下游反应，促进细胞凋亡的发生，基因定位于12号染色体长臂。成熟Smac以纯二聚体的形式存在于线粒体的膜间腔，且此二聚体结构非常稳定[15]，其促凋亡功能的发挥有赖于其从线粒体释放到胞质。在细胞受凋亡信号刺激后，Smac线粒体定位信号肽被切除释放入胞质，特异地结合IAPs，解除IAPs对凋亡下游效应caspases的抑制，从而促进细胞凋亡。实验证实[16, 17]，Smac不诱导正常细胞的凋亡，在正常生理情况下，可能仅起微小的促凋亡的作用，其功能发挥有赖于胞内定位的改变。Smac是目前发现的唯一能同时直接抑制多个IAPs家族成员活性的凋亡相关蛋白，N末端20个氨基酸残基对Smac-IAP间的相互作用是至关重要的，这一区域的剔除将完全破坏Smac与IAP结合的能力。但也有研究指出[18]，尽管缺乏N末端IAP结合序列(IBM)的Smacβ不能与IAP相互作用，Smacβ却仍具有促凋亡活性，因此推测，Smac、Smacβ的促凋亡功能的发挥，除与IAPs相结合外，也可能存在其他的机制，需要进一步证实。
Smac促凋亡作用是通过逆转IAPs，尤其是逆转XIAP而实现的。Smac能消除IAPs对caspase的抑制作用而激活caspase酶原，同时增强caspase酶活性的双重功效。Smac能消除IAPs对caspase-3、caspase-7、caspase-9的抑制作用，从而caspase被相继激活，发生caspase级联效应，促进凋亡。Smac以氨基末端保守序列Ala-Val-prolle(AVPI)结合BIR3，而Smac有比caspase-9更强的亲和力；Smac-BIR2的结合使caspase抑制被解除；同时Smac能解除IAPs重复区对caspase-9的抑制，保证caspase-9对caspase-3活化的进行[19]。Smac还能与XIAP的BIR2紧密结合，从而与caspase-7竞争性结合BIR2，这也促进了Smac与BIR3的结合。Smac能促进pro-caspase-3水解，且增强成熟caspase-3的活性[20]。XIAP的BIR结构是caspase和Smac结合的结构基础[21]。BIR1与BIR2、BIR3同源，但Smac与BIR2、BIR3作用，不与XIAP-BIR1结合。
2.3 NF-κBNF-κB为一个转录因子蛋白家族，NF-κB通过诱导TRAF和IAP抑制凋亡。TRAF与其相应的配体TNF结合后，在诱发细胞凋亡的同时，激活细胞内NF-κB。NF-κB抗凋亡机制作用于caspase-8和线粒体的上游，进一步研究表明，NF-κB在基因和蛋白表达两个水平上控制了TRAF-1、TRAF-2、c-IAP1、c-IAP2的表达，从而抑制了caspase-8的活性。此途径也是NF-κB抗细胞凋亡的重要机制。c-IAP1和c-IAP2是首先被发现与TRAF相关联的IAP家族成员，c-IAP2抑制凋亡的功能与NF-κB的活化有关。c-IAP2大量表达使I-κB降解，从而导致NF-κB活化来抑制凋亡。活化的NF-κB诱导包括IAPs在内的多种抗凋亡基因的表达。尽管目前对于IAPs是否为NF-κB活化抗凋亡作用的必需基因尚不明确，但大量研究表明，IAPs可能为NF-κB的调节基因。
3 以IAPs为靶点的药物研发BIR2结构域，或者更准确地说是BIR1和BIR2之间的连接部位,是负责抑制caspase-3/7[22, 23]活性的关键部位。许多研究都描述过这种抑制的关键结构[6, 8, 24]。就caspase-3来说，BIR2结构域似乎具有重要的约束力，合成肽不足以抑制caspase，然而一个片段含有完整的连接肽和BIR2结构域则具有强大的抑制活性。至于caspase-7，BIR2结构域似乎是一个可有可无的部分。上述显示，BIR2结构域已经呈现出对caspase-3稳定的抑制作用[6, 8, 24, 25]。另一方面，Smac-XIAP的结合牵涉到与BIR2结构域的紧密的相互作用，并不是与连接域直接的相互作用。这说明Smac与BIR2结构域结合可能是通过破坏与caspase-7的结合来导致caspase的脱抑制[6, 24]。
BIR3结构域能够抑制caspase-9的活性，而caspase-9是线粒体介导caspase激活凋亡途径中的起始caspase[26]。通过对BIR3结构域与caspase-9结合的结构进行分析，发现BIR3与caspase-9单体形成异源二聚体，使caspase-9不能保持单体结构，丧失催化活性[26, 27]。BIR3结构域上的caspase-9结合区域正是蛋白抑制剂的设计靶点。caspase-9和BIR3之间的结合位点说明了IAP结合序列(IBM)与BIR3的肽段结合是关键性的。已经证明，BIR3无法结合和切割被激活的caspase-9，但通过成熟Smac的N末端残基与BIR3的相互作用，Smac能够拮抗XIAP对caspase-9的抑制。这种结合对抑制的关键作用是通过Smac-N末端促进procaspase-3的活化而实现的。尽管内源性IAP拮抗剂在正常生理条件下定位于不同的细胞器，但当细胞接受外源刺激后，通过改变线粒体膜通透性，Smac/DIABLO蛋白从线粒体释放进入细胞质，通过其N端与IAPs家族蛋白的BIR3结构域结合，阻断caspase-IAP复合物形成，促进细胞凋亡[28]。
4 展望肿瘤的形成是细胞增殖和凋亡失衡的结果，凋亡的抑制延长了肿瘤细胞的生存时间，为肿瘤细胞的生长提供了条件。Smac、XIAP的表达异常与肿瘤的发生、治疗及预后关系密切。Smac在肿瘤中低表达或缺失，而XIAP反之。近年来的研究主要致力于Smac类似物的开发[29]。Smac只诱导肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞的特点，引起各国研究人员的注意，希望可以将其应用于肿瘤靶向治疗。Smac和XIAP的发现，尤其是两者与caspase之间的联系，为疾病诊断治疗提供了新思路。IAPs作为一种内源性的细胞凋亡抑制蛋白，在肿瘤的发生发展中也必然扮演着非常重要的角色。目前，以IAPs家族蛋白为靶点的抗肿瘤耐药治疗研究有了初步进展，拮抗IAPs蛋白的治疗策略初步显示具有对特定肿瘤细胞的选择性。但是，机体对细胞凋亡的调控是极其复杂的，还需要不断认识人类肿瘤中IAPs抑制细胞凋亡的确切分子机制，如认识IAP抑制剂对肿瘤和相应正常细胞的敏感性、小分子抑制剂在体内潜在的毒副作用等，为肿瘤的临床治疗提供新的思路和方案。因此，进一步研究IAPs在肿瘤中的作用对于阐明肿瘤的发生机制、治疗及药物研发有着重要的意义。
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