2. 沈阳医学院环境污染与微生态重点实验室, 辽宁 沈阳 110034
2. Key Lab of Environmental Pollution and Microecology, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China
随着呼吸系统相关疾病的深入研究,很多科研机构的实验室对小鼠气管滴注操作方法不断的进行革新,随之成功有效的技术手段得到广泛的应用。为了本课题组开展进一步科学研究的需要,我们建立了应用冷光源内窥镜直视技术进行小鼠气管滴注的新方法,这种方法的应用和推广将从经济和技术层面帮助到更多实验室的科研人员。本文简要描述具体的操作方法和要点,期待与广大研究者进行探讨和学习。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物20只清洁级♂ CB17-SCID小鼠[体质量24~28 g,许可证号:SCXK (京) 2012-0001]购于北京维通利华动物实验动物技术有限公司,常规饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物房内,12/12 h昼夜光照,动物房温度为22~24℃,湿度为70%。
1.1.2 材料乙醚(国药集团化学试剂有限公司)、冷光源硬性内窥镜(外径2.7 mm,徐州科能光电设备有限公司)、1~200 μL Pipette Tip (Thermo Fisher,Cat.# 010-Q)、2-20μL单通道移液器(Eppendorf,Germany)、空气污染细颗粒物悬液(实验室保留)、钝头镊子、50 mL离心管、棉球以及自行购置和设计的小鼠口腔撑开装置(1#手术线、铁架台)。如Fig 1所示。
1.2 操作方法 1.2.1 操作人员首先在50 mL离心管底部填充约10 mL左右空间的棉球,然后用加长巴氏吸管向棉球内部添加5 mL乙醚液体(大约能麻醉10只小鼠),如果需要不断的增加小鼠麻醉数量,适时补充乙醚的使用剂量。对小鼠进行麻醉处理,观察小鼠的呼吸频率,待呼吸由急促转慢时,将其上牙挂置于固定于铁架台的手术线上面(Fig 2),此时如果小鼠苏醒,重复进行麻醉。用钝头镊子将其舌部拉出固定,并将小鼠整个躯体固定,使口腔撑开便于另一操作人员完成气管插管的处理。 1.2.2 操作人员一手持冷光源内窥镜,观察开闭的声门(Fig 3),一手持移液器,待声门关闭前准确完成气管滴注过程,完成滴注过程的操作者要熟练冷光源内窥镜和插管工具点样吸头间的配合。完成上述操作内容平均每只动物需要2~3 min。 2 结果所有实验小鼠气管滴注均获得成功。滴注方法测试,将小鼠处死后,解剖可见气管下端至肺部位置均有黑色物质散在分布(Fig 4),判定实验技术方法有效,气管滴注成功。
3 讨论随着近年各学科研究的飞速发展,进行呼吸道给药染毒操作的小鼠实验的需求呈上升趋势。但是由于小鼠口腔狭小,很难通过眼睛直视观察到声门,即气管的开口,所以对小鼠的气管插管操作很多研究者采用手术暴露颈部气管的方式,这种方法易操作,对实验动物造成的损伤大[1, 2, 3]。其他相关研究也对非手术方式小鼠气管滴注方法进行了介绍[4, 5, 6, 7, 8],但操作方法都过于繁琐,或是用药的剂量无法进行准确的计算。
应用冷光源内窥镜和点样吸头完成的小鼠气管滴注法具有以下优点:① 电泳点样枪头的应用,对于操作者更加的简便,使插管操作灵活,可重复完成,同时对于小鼠更加的安全,电泳点样吸头有一定的韧性和弯曲性,并且前端较细一级吸头可以插入到支气管附近位置,是一个理想的小动物实验插管工具。② 冷光源直杆内窥镜所选择的冷光源不会烫伤小鼠的口腔和气管部位组织,避免了组织损伤所引起的一系列炎症反应,另外镜头可以将小鼠气管的声门放大3倍以上,便于操作者观察,从而更加顺利的完成插管实验。③ 如果是完成连续滴注实验,可以用戊巴比妥钠溶液进行麻醉,对小鼠口腔通过手术线挂牙的方式打开,进行点样吸头可视化插管;如果完成单次的气管滴注实验,用乙醚对小鼠麻醉,借助可视化移液器加样的方法进行气管滴注。
操作的注意事项:①控制麻醉的深度,当小鼠的呼吸频率由快到慢时,10 s后从麻醉容器中取出,进行下一步实验;②用镊子向外拉动舌头要适度,既要保证撑开口腔,又要避免损伤到小鼠;③滴注前,要对点样吸头插管深度进行解剖观测;④滴注时,由于操作空间较小,先放入点样吸头,再用冷光源内窥镜观察声门和吸头进行下一步操作;⑤为了保证实验的成功,还需进行滴注液体体积的测试,通常滴注液体为20~50 μL;⑥注意观察声门时不要使点样吸头接触到食管,以免产生气泡黏液,影响插管实验。
综上所述,采用实验室常用的点样吸头和一种冷光源内窥镜,大胆的改进和创新了实验操作的滴注方法,熟练此种技术只需经过数次初步的练习即可实施实验。可见,应用冷光源内窥镜和电泳点样吸头进行的气管滴注新方法操作快速、简洁,可重复性好,能够广泛用于小鼠呼吸系统的插管和滴注操作。
[1] | 孟婕, 彭张哲, 陶立坚. 小剂量多次尾静脉注射与气管内滴注博来霉素致小鼠肺纤维化模型的比较研究[J].中南大学学报:医学版, 2013,38(12):1228-32. Meng J, Peng Z Z, Tao L J. Murine pulmonary fibrosis model induced by repeated low-dose intravenous injection and intratracheal instillation of bleomycin[J]. J Cent South Univ (Med Sci), 2013,38(12):1228-32. |
[2] | 苑少欣, 孔雅娴, 李蕊, 等. 气管滴注法与雾化吸入法建立小鼠急性肺损伤模型及其效果比较[J/CD].中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2014,8(2):163-7. Yuan S X, Kong Y X, Li R, et al. Establishment and effectiveness comparison of mouse models of acute lung injury by intratracheal instillation and aerosol inhalation[J/CD]. Chin J Exp Clin Infect Dis (Electr Ed), 2014,8(2):163-7. |
[3] | Helms M N, Torres-Gonzalez E, Goodson P, et al. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung[J/OL]. J Vis Exp, 2010,(42), e1941. |
[4] | Zeki A A, Bratt J M, Chang K Y, et al. Intratracheal instillation of pravastatin for the treatment of murine allergic asthma:a lung-targeted approach to deliver statins[J]. Physiol Rep, 2015,3(5), e12352. |
[5] | 徐尤年, 马璞, 张曌,等. 直视下小鼠气管插管方法的比较[J].中国医师杂志, 2010,12(6):740-2. Xun Y N, Ma P, Zhang Z, et al. Comparison of two techniques for endothacheal intubation in mice[J]. J Chin Physician, 2010,12(6):740-2. |
[6] | 曹婕, 高润娣, 李和权, 等. 在头戴式放大镜直视下小鼠气管插管方法的建立[J].中国药理学通报, 2012,28(5):729-31. Cao J, Gao R D, Li H Q, et al. A method for tracheal intubation of mice under direct vision through head-wearing kind magnifying glass[J]. Chin Pharmacol Bull, 2012,28(5):729-31. |
[7] | 贾晓峰, 郭新彪. 改进型快速小鼠气管滴注法-透射灯下经口直视滴注法研究[J].环境与健康杂志,2012,29(3):217-9. Jia X F, Guo X B. Improved technique for rapid endotracheal instillation in mice:directviewing intubation through oropharynx under the trans-illumination[J]. J Environ Health, 2012,29(3):217-9. |
[8] | Liu F,Li W,Paulutm J,et al.Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats:comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation[J].Toxicology,2013,304(1):158-66. |