缺血性脑损伤的病理过程极其复杂，其发病机制涉及脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、氧化应激损伤、炎症反应等诸多环节。最后，由于激活细胞凋亡基因导致细胞程序性死亡，使缺血半暗带区及梗死区融合。已经证实，在MCAO模型中，线粒体p53可通过转录依赖的机制来激活细胞的凋亡[1]。此外，脑缺血时钙离子在细胞内的大量聚集，引起大量兴奋性氨基酸及神经递质的释放，并且会激活大量的磷酸化酶，例如凋亡蛋白酶(caspase)[2]，加速了神经细胞的凋亡。
CRMP2(collapsin response mediator protein 2)是胞质磷酸化蛋白CRMP1-5家族成员之一，可参与调解多种神经生理活动，如：微管动力学、轴突出芽及回缩、神经分化、树突/轴突特化、依赖驱动蛋白的轴突转运、钙离子内态稳定性、神经介质释放等[3, 4, 5]。研究证实，CRMP2可抑制凋亡前体基因p53的表达，调节Sema3A诱导的细胞凋亡[6, 7]。它还可调节NMDA受体的功能，与N型电压门控钙离子通道的α1B亚单位相互作用，稳定了钙离子内流[8, 9]。因此，我们推测CRMP2可能是一个通过调控凋亡反应起到脑缺血后神经保护作用的蛋白。
本实验采用立体定位方式向颅内注射CRMP2真核表达质粒，使大鼠缺血侧脑组织过表达CRMP2，再进一步观察CRMP2对大鼠缺血/再灌注损伤后神经细胞凋亡及神经功能的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物及材料Sprague-Dawley ♂大鼠192只(重医大动物实验中心提供)，体质量220~270 g，(20~25)℃室温饲养，自然进水和食物。RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；兔抗CRMP2(美国CST)；山羊抗兔二抗(Proteintech Group,Inc)；TTC(美国Sigma)；兔抗BDNF(美国Abcam)；山羊抗兔二抗试剂盒(博士德)。
1.2 方法 1.2.1 真核表达质粒立体定位注射右侧侧脑室注射：以前囟为坐标0点，向右1.5 mm，向后1.2 mm，深4.5 mm。将带有GFP的空白质粒、真核表达质粒(160 mg·L-1)注射至大鼠侧脑室内，一次注射总量为4 μL，速度为0.3 μL·min-1，留针5 min。
1.2.2 MCAO/再灌注模型制作与分组采用随机数字的方法将192只大鼠随机分为sham组、MCAO组、MCAO+GFP组、MCAO+CRMP2/GFP组,每组6只。脑立体定位注射后1 d，参照本课题组前期的实验方法[10]，采用Longa评分，1~3分的模型纳入实验，其余剔除，并从同批次实验模型大鼠中随机补齐。
1.2.3 Western blot检测将各组大鼠脑缺血区域皮质取下，液氮速冻，-80 ℃保存。参照碧云天蛋白提取试剂盒提取蛋白用于检测。蛋白样品在浓度分数为0.1的SDS-PAGE凝胶中分离并转移至0.45的PVDF膜上，浓度分数为0.05的脱脂奶粉封闭90 min，CRMP2(55~65 ku)一抗(1 ∶1 000)4 ℃过夜，山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育1 h，采用fusion软件检测与分析。
1.2.4 RT-PCR检测灭酶器械取组织标本，参照RNA提取及逆转录试剂盒说明书处理得组织cDNA,-80 ℃保存。引物序列如下：CRMP2上游(21 bp)5′-TCCGGTCTGTTCTGGCTTTTTC-3′，下游(21 bp)：5′-AGGGTCCGCTCAGGCTGTGTC-3′;p53上游(19 bp)5′-CTGGACGACAGGCAGACTT-3′，下游(19 bp)5′-CAGCGTGATGATGGTAAGGA-3′；BCL2上游(19 bp)5′-GGTGGACAACATCGCTCT-3′，下游(20 bp)5′-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3′；Caspase-3上游(20 bp)5′-AAAGGAATGACTGGGAGTGG-3′，下游(20 bp)5′-AATGACGACCTGGAACATCG-3′，Caspase-8上游(20 bp)5′-AGCCCA TCTTCACACTACGG-3′，下游(22 bp)5′-AGCACACATCAGTTAGGACACA-3′。用SYBR GREEN进行扩增反应。
1.2.5 免疫组化及TUNEL染色各组大鼠缺血/再灌注后48 h及1周，PBS加多聚甲醛(体积分数0.04)经升主动脉灌注取脑，固定24 h，脱水，冰冻切片(10 μm/片)。切片微波修复后进行BDNF一抗及相应的二抗孵育，中性树胶封片；用于检测TUNEL的组织，固定脱水后石蜡包埋切片，切片脱蜡后按照TUNEL染色试剂盒说明书进行染色，中性树胶封片。光镜400倍下，每个脑组织随机选取3个脑片，每个脑片的缺血半暗带随机选取5个区域，计算平均数。
1.2.6 TTC染色及神经功能评分各组大鼠缺血/再灌注48 h后断头取脑，脑组织纵向切成2 mm厚度的脑片，TTC浸泡染色20 min，拍照，软件分析脑梗死体积百分比。神经功能评估采用评分者单盲的方法，参照Garcia[10]的评分标准进行评分，最低3分，最高18分，得分越低表示神经功能缺损越严重。
1.3 统计学分析采用SPSS22.0对数据进行分析，结果以x± s 表示，多组间比较运用AVONA分析，两两比较行LSD检验。
2 结果 2.1 脑缺血/再灌注后各组大鼠CRMP2 mRNA及蛋白的表达脑缺血/再灌注48 h及1周后，检测CRMP2的表达，结果提示：缺血/再灌注48 h CRMP2的表达较假手术组降低(P <0.01)，1周后CRMP2的表达较48 h时降低更明显(P <0.01)。真核表达质粒使缺血侧脑组织CRMP2的表达在两个时间点均明显上调，与MCAO和MCAO+GFP组比较差异具有统计学意义(P <0.01)(Fig 1)。
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| Fig 1 Expression of CRMP2 at 48 h and 1 wk in ischemia penumbra of four groups A~B:Western blot assay of CRMP2 expression. C:The bar graph reflected CRMP2 mRNA expression; **P <0.01 vs sham group;##P <0.01 vs MCAO+CRMP2/GFP group;△△P <0.01 vs MCAO group;1：sham group；2：MCAO group；3：MCAO+GFP group；4：MCAO+CRMP2/GFP group |
脑缺血/再灌注48 h及1周，与sham组比较，缺血/再灌注后BCL2的mRNA的表达水平明显降低(P <0.01)，而同时Caspase-3、Caspase-8以及p53的mRNA表达升高(P <0.01)；与MCAO及MCAO+GFP组比，真核质粒干预脑缺血组织后升高了BCL2的mRNA水平(P <0.01)，同时明显降低了p53、Caspase-3、Caspase-8的mRNA水平(P <0.01)(Fig 2)。
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| Fig 2 Expression of BCL2，p53，Caspase-8 and Caspase-3 at 48 h and 1 wk in ischemia penumbra of four groups A~D:The bar graph reflected p53,BCL2,Caspase-8 and Caspase-3 mRNA expression. **P <0.01 vs sham group;##P <0.01 vs MCAO+CRMP2/GFP group;△△P <0.01 vs MCAO group. The bar graph refiected the expression of p53mRNA(A), BCl2 mRNA(B) Caspase-8 (C) and Caspase-3(D) |
在假手术组，缺血侧皮质有少量的凋亡细胞，而在缺血/再灌注48 h后，可见有大量的TUNEL阳性细胞存在。与MCAO及MCAO+GFP组比较，给予过表达CRMP2干预后，该部位TUNEL阳性细胞有所减少(P <0.01)(Fig 3)。
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| Fig 3 Expression of TUNEL positive cells at 48 h and 1 wk in ischemia penumbra of four groups (400×) The black arrow for TUNEL positive cells.**P <0.01 vs sham group;##P <0.01 vs MCAO+CRMP2/GFP group;△△P <0.01 vs MCAO group |
大鼠缺血/再灌注之后48 h及1周，各组BDNF的表达均较假手术组升高(P <0.01)；过表达CRMP2使该组BDNF的表达较另外两组明显升高(P <0.01)(Fig 4)。
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| Fig 4 Expression of BDNF positive cells at 48 h and 1 wk in ischemia penumbra of four groups (400×) The black arrow for BDNF positive cells.**P <0.01 vs sham group；##P <0.01 vs MCAO+CRMP2/GFP group；△△P <0.01 vs MCAO group |
再灌注后48 h，MCAO组及MCAO+GFP组大鼠缺血侧可见明显的梗死灶，并伴有严重的神经功能缺损(P <0.01)；真核质粒干预后梗死灶明显缩小(P <0.01)，神经功能缺损明显减轻(P <0.01)。1周后，缺血各组大鼠的神经功能均有所恢复，但MCAO+CRMP2/GFP组的神经功能评分明显高于其他两组(P <0.01)(Fig 5、Tab 1)。
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| Fig 5 The cerebral infarct volume of at 48h for four groups **P <0.01 vs sham group;##P <0.01 vs MCAO+CRMP2/GFP group |
| Group | 48 h | 1 wk |
| Sham | 14.9±0.220 | 14.95±0.168 |
| MCAO | 6.10±0.156** | 8.98±0.166* |
| MCAO+GFP | 5.97±0.147**## | 8.86±0.211**## |
| MCAO+CRMP2/GFP | 9.97±0.203**△△ | 11.96±0.135**△△ |
| **P <0.01 vs sham group; ##P <0.01 vs MCAO+CRMP2/GFP group;△△P <0.01 vs MCAO group | ||
脑缺血或者脑缺血/再灌注损伤的病理过程极为复杂，包括兴奋性氨基酸毒性、离子不平衡、氧化应激、炎症反应、自噬、凋亡及细胞坏死等[11]。研究证实，细胞程序性死亡在大鼠局灶性脑缺血的病理生理过程有重要的作用，导致大量神经细胞及传导束的损害[12]。脑缺血后大量神经细胞死亡，对神经功能产生严重的不良影响，而缺血半暗带区大部分神经细胞死亡以凋亡为主[13]。
大鼠脑缺血之后神经细胞的死亡通过坏死和凋亡两种机制进行[14]。在各种应激及损伤的情况下，线粒体内膜损伤释放出细胞色素C启动内源性线粒体凋亡通路，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子结合，可促进Caspase-9前体的自身活化，之后激活Caspase-3前体，从而导致DNA降解，同时破坏维持细胞的完整性的必需物质[15]。线粒体凋亡途径也可以通过激活细胞膜表面死亡配体[16]，如干扰素，诱导TNF相关凋亡诱导配体和Fas/FasL引起Fas相关死亡结构域蛋白的激活，后者依次激活Caspase-8及下游的Caspase家族[17]，Caspase-8的激活使Bid裂开，导致线粒体膜电位瓦解并引起细胞凋亡[18]。本实验研究发现，脑缺血/再灌注后48 h及1周，过表达CRMP2使缺血侧脑皮质BCL2表达升高，而Caspase-3、Caspase-8及p53的表达降低。此外，过表达CRMP2使TUNEL阳性细胞减少，减少了脑梗死体积，并更大程度的减轻了神经功能的缺损。研究表明，p53能上调BAX并下调BCL2[15]，而脑缺血组织中BCL2的表达升高可以调节线粒体膜上钙离子的内流，维持线粒体膜的完整性及调控氧化应激反应，从而改善细胞凋亡。因此，我们推测CRMP2可以通过调节内源性线粒体通路调控细胞凋亡。
同时，本实验还显示，CRMP2的过表达上调了BDNF的表达。已有研究证实，通过Slp1/Rab27B/CRMP-2/Kinesin-1通路募集TrkB传送到轴突终端是BDNF信号传输的关键[19]。BDNF可通过依赖ERK方式激活转录因子CREB和NFκB，从而增加抗凋亡基因Bcl2家族的表达，另一方面，BDNF可激活PKC，进一步调节GSK3的磷酸化。而GSK3的磷酸化是细胞存活还是死亡的重要平衡因子[20]。从而，我们推测CRMP2可能通过调节BDNF/CREB通路及BDNF/PLC/PKC/GSK3通路来影响细胞凋亡。此外，大量的钙离子在细胞内聚集，将激活凋亡蛋白酶(Caspase)，引起细胞凋亡[15]。钙离子的内流受NMDA受体调控，而CRMP2又可调节NMDA受体的功能[8, 9]。因此，我们还推测，CRMP2通过BDNF/NMDA通路调节细胞内钙离子的内流，参与了对细胞凋亡的调控。这些假设将在后续的试验中进行论证。
综上所述，过表达CRMP2能够减轻脑缺血/再灌注损伤后脑组织神经细胞的凋亡反应，缩小脑缺血/再灌注后的脑梗死体积，促进神经功能的恢复。这可能与CRMP2参与调节内源性线粒体凋亡通路及BDNF相关通路(如CRMP2/BDNF/CREB、CRMP2/BDNF/PLC/PKC/GSK3以及CRMP2/BDNF/NMDA)有关。本课题组拟在今后的研究中继续探索CRMP2的神经保护作用并证实相关机制。
(致谢：本文实验在重庆医科大学神经病学重点实验室完成，在此表示感谢！)
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