2. 应用心理学教研室, 山东 潍坊 261053
2. Dept of Psychology, Weifang Medical College, Weifang Shandong 261053, China
支气管哮喘是一种炎症性呼吸系统疾病，严重影响人类健康 [1, 2]。NF-κB/MAPK信号通路可介导炎症反应，在哮喘发生、发展中发挥重要作用[3, 4]。目前治疗哮喘以激素等为主，久用不良反应较大。中医中药在哮喘防治方面积累了大量经验，黄芪作为一种具备免疫调节功能的药物，在哮喘的防治上发挥着重要作用。黄芪提取物黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)在多种疾病的动物模型中显示了良好的抗炎作用[5]，课题组前期研究发现，APS可抑制支气管哮喘大鼠气道炎症并调节Th17/Treg 细胞因子表达[6]。但是，APS治疗哮喘的机制是否与调节NF-κB/MAPK信号通路有关未见报道，本研究拟就上述问题进行探索。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与分组健康♂Wistar大鼠,体质量(200±20) g(山东大学实验动物中心，合格证号：SCXK鲁2003-0004)，随机分为正常组、哮喘组、APS组，每组8只。
1.1.2 药品试剂与仪器卵蛋白(ovalbumin，OVA)购于美国Sigma公司，氢氧化铝购于淄博化学试剂公司，NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及 IL-13酶联免疫试剂盒购于美国Cell Signaling公司、R&D公司、武汉华美公司及上海邦奕公司。雾化泵(德国PARI公司)，H-7500 型透射电子显微镜(日立公司) 。
1.2 方法 1.2.1 模型制备哮喘组、APS组大鼠于分组后第1天(d 1)，腹腔注射致敏液混悬剂2 mL(含有OVA 100mg，氢氧化铝200 mg)，于d 8第2次注射致敏液。从d 15起，大鼠接受连续28 d的1% OVA雾化吸入(20 min，40 mL)，每日1次。正常组仅腹腔注射及雾化吸入生理盐水。
1.2.2 药物治疗从d 1 开始，大鼠接受连续6周的药物干预。APS组予以腹腔注射APS 400 mg·kg-1·d-1 (多项动物实验显示，该剂量在大鼠体内可发挥多种药理学效应[7]，课题组前期研究也发现，该剂量在大鼠体内具有免疫调节、抗炎等作用[6])，正常组及哮喘组腹腔注射等体积的生理盐水。
1.2.3 HE染色治疗结束处死大鼠，取右肺组织，10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片(4 μm)，进行HE染色，光镜分析病理变化。
1.2.4 电镜处死大鼠后，迅速取1 mm3大小的肺组织置于2.5%戊二醛前固定，继以1%锇酸后固定，脱水环氧树脂包埋，超薄切片(1 μm)铀铅染色，电镜观察肺泡Ⅰ型上皮超微结构。
1.2.5 肺泡灌洗液炎症细胞计数左侧肺脏以生理盐水(37 ℃)灌洗，收集灌洗液，2 500 r·min-1离心10 min。回收细胞进行瑞氏染色，光镜下分类计数炎症细胞数量。
1.2.6 ELISA检测取右肺新鲜组织，加入4 ℃生理盐水匀浆(1 g 组织加入2 mL生理盐水)，2 500 r·min-1离心10 min，取上清液，ELISA法检测其中NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及 IL-13含量。ELISA操作严格按说明书进行。
1.2.7 统计学处理计量资料以x±s表示，采用SPSS 13. 0软件对数据进行单因素方差分析，组间差异比较采用q检验。
2 结果 2.1 APS对BALF中炎症细胞数量的影响与正常组比较，哮喘组BALF中含有更多数量的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞(P < 0.05)；与哮喘组比较，APS组BALF中上述炎症细胞数量均明显降低(P < 0.05)；但APS组上述炎症细胞数量仍明显高于正常组(P < 0.05)。见Tab1。
| Macrophages | Eosinophils | Lymphocyte | Neutrophil | |
| Normal | 6.07±1.14 | 0.06±0.01 | 10.24±1.63 | 3.41±0.55 |
| Asthma | 15.72±2.05 # | 1.96±0.30 # | 28.07±4.34 # | 6.80±0.69 # |
| APS | 10.35±2.10 #△ | 1.05±0.26 #△ | 17.84±2.95 #△ | 5.03±0.71 #△ |
| # P < 0.05 vs normal group; △ P < 0.05 vs asthma | ||||
HE染色显示，正常组未见异常，肺泡轮廓完整清晰，未见明显的炎症细胞浸润。哮喘组肺泡轮廓欠清晰，肺泡壁明显水肿、增厚，部分肺泡扩张，大量炎症细胞浸润。与哮喘组比较，APS组肺泡轮廓较清晰，肺泡壁水肿明显减轻、炎症细胞浸润明显减轻；但与正常组比较，APS组仍存在较明显的肺泡壁水肿、炎症细胞浸润等表现。见Fig1。
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| Fig 1 Effects of APS on histological changes of lung tissue A: Normal; B: Asthma; C: APS |
电镜下可见，哮喘组大鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞线粒体肿胀、嵴模糊，高尔基复合体不发达，染色质聚集。与哮喘组比较，APS组大鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞上述超微结构变化明显减轻。见Fig2。
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| Fig 2 Effects of APS on ultrastructure of type Ⅰ pneumocyte A: Normal; B: Asthma; C: APS |
与正常组比较，哮喘组肺部NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα含量明显升高(P < 0.05)。与哮喘组较，APS组肺部NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα含量明显降低(P < 0.05)；但APS组上述指标含量仍高于正常组(P < 0.05)。见Tab2。
| NF-κB p65/ng·L -1 | p-NF-κB p65/ng·L -1 | p-IκBα/ng·L -1 | |
| Normal | 39.55 ± 5.17 | 13.80 ± 2.10 | 11.16 ± 2.05 |
| Asthma | 82.09±11.20 # | 43.26±5.28 # | 33.71±5.39 # |
| APS | 59.14±7.06 #△ | 22.53±4.31 #△ | 20.80±3.51 #△ |
| # P < 0.05 vs normal group; △ P < 0.05 vs asthma | |||
与正常组大鼠比较，哮喘组肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量明显升高(P < 0.05)。与哮喘组比较，APS组肺部上述指标含量明显降低(P < 0.05)；但APS组上述指标含量仍高于正常组(P < 0.05)。见Tab3。
| ERK1/2/ng·L -1 | JNK/ng·L -1 | p38 MAPK/ng·L -1 | p-ERK1/2/ng·L -1 | p-JNK/ng·L -1 | p-p38 MAPK/ng·L -1 | |
| Normal | 33.01 ± 5.17 | 40.17 ± 5.83 | 52.71± 7.50 | 8.36 ± 1.58 | 11.96± 2.34 | 14.71 ±2.83 |
| Asthma | 54.77±6.83 # | 75.92±9.44 # | 95.60±9.82 # | 26.70±3.12 # | 36.41±4.88 # | 50.15±7.24 # |
| APS | 43.50±5.36 #△ | 56.80±7.33 #△ | 70.42±8.39 #△ | 15.38±2.66 #△ | 21.49±3.10 #△ | 30.70±5.89 #△ |
| # P < 0.05 vs normal group； △ P < 0.05 vs asthma group | ||||||
与正常组比较，哮喘组肺组织炎性细胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13含量明显增高(P < 0.05)。与哮喘组比较，APS组上述细胞因子含量明显降低(P < 0.05)；但APS组含量仍高于正常组(P < 0.05)。见Tab4。
| IL-1β/ng·L -1 | IL-4/ng·L -1 | IL-5/ng·L -1 | IL-6/ng·L -1 | IL-13/ng·L -1 | |
| Normal | 79.33±10.74 | 51.08±8.29 | 49.93±7.39 | 69.52±8.13 | 41.83±6.05 |
| Asthma | 178.72±17.36 # | 147.36±18.55 # | 163.80±20.39 # | 152.04±18.29 # | 123.16±15.87 # |
| APS | 123.03±15.37 #△ | 101.58±14.80 #△ | 93.72±15.77 #△ | 114.60±14.58 #△ | 96.37±12.90 #△ |
| # P < 0.05 vs normal group； △ P < 0.05 vs asthma group | |||||
本研究首先观察了APS对哮喘大鼠肺部炎症的影响，结果表明，APS明显降低了哮喘大鼠BALF炎症细胞数量、抑制了肺组织炎症反应。肺泡Ⅰ型上皮对于维持正常的肺功能具有重要的作用，哮喘时该上皮易受累，导致呼吸功能下降。本研究结果显示，APS明显改善了OVA诱导的肺泡Ⅰ型上皮超微结构损伤。既往研究也就APS对哮喘的疗效进行了探讨，宋泽庆等发现APS对哮喘小鼠特异性免疫治疗具有增强作用。俞建芬等报道APS可改善哮喘小鼠气道高反应性及气道重塑。课题组前期研究显示APS可调节哮喘大鼠Th17/Treg细胞因子平衡[6]。这些研究均证明APS对哮喘具有治疗作用。
近年研究显示，NF-κB/MAPK信号通路过度激活在哮喘的发病中发挥作用[3, 4]。通常NF-κB被IκB抑制，以非活性形式存在于细胞质。当IκB发生磷酸化，失去了对NF-κB的抑制作用，活化的磷酸化-NF-κB可转位至细胞核，促进基因转录，继而增加炎性细胞因子表达，促进哮喘发展。本研究显示，哮喘组NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα表达升高，表明NF-κB通路过度激活。其他研究也显示哮喘动物NF-κB通路活性较正常动物增加[9, 10]，与本研究结果一致。本研究中，APS组大鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα表达较哮喘组明显降低，表明APS可明显抑制NF-κB通路活性。MAPK信号通路在炎症反应中发挥重要作用，MAPK信号通路主要包括分别由ERK1/2、JNK、p38 MAPK介导的三条级联反应，该通路的激活可促进炎症细胞因子的生成而加剧炎症反应。有研究表明哮喘动物MAPK信号通路较正常动物活性增强[11]。本研究显示，哮喘组大鼠肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量较正常组明显升高，这与既往报道相一致[11, 12, 13]。本研究中，APS明显降低了哮喘大鼠肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量，表明APS可抑制OVA诱导的MAPK信号通路过度激活。
本研究尚检测了大鼠肺部NF-κB/MAPK信号通路下游炎性细胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13的表达。结果表明哮喘组大鼠上述细胞因子水平明显升高，这同既往其他研究报道一致[14, 15, 16]。在本研究中，与APS抑制NF-κB/MAPK信号通路的过度激活相一致，APS也明显抑制了哮喘大鼠炎性细胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13表达。
综上所述，OVA引起了大鼠NF-κB/MAPK信号通路过度激活以及炎性细胞因子过度分泌。与文献报道一致，上述通路的激活以及炎性细胞因子的过度分泌，可引起炎症级联反应、加剧肺部炎症，促进肺上皮损伤，增加气道反应性，并引起气道重构 [3, 4, 17, 18]。针对此，大量研究以药物对哮喘进行干预，旨在降低NF-κB/MAPK信号通路的过度激活及炎症因子的过度分泌，结果表明能改善上述靶点的药物，可明显减轻哮喘病变[3, 4, 19]。本研究中，APS亦明显降低了OVA引起的NF-κB/MAPK信号通路过度激活及炎症因子过度分泌，同时减轻了肺部炎症以及肺泡Ⅰ型上皮细胞超微结构损伤，理论上推测大鼠哮喘表现的好转可能与APS抑制NF-κB/MAPK信号通路及炎症因子水平有关。在既往报道中，虽然有众多的中药提取物表现出了一定的抗哮喘作用，但与阳性对照药物糖皮质激素比较，多数提取物均未达到或优于糖皮机制激素的疗效[20, 21]。与此类似，本研究中APS虽然明显抑制了NF-κB/MAPK信号通路及炎症因子分泌，但其水平仍明显高于正常对照组，与此一致，APS组虽然肺部炎症得到缓解，但与正常组比较，仍然存在显著的炎症，故APS对哮喘时的肺部炎症仅有部分缓解作用。
总之，APS可明显缓解哮喘大鼠肺部炎症反应，同时减低了NF-κB/MAPK信号通路活性。故推测，APS改善哮喘的作用可能与抑制NF-κB/MAPK信号通路有关。
(致谢：本研究在山东省潍坊医学院应用药理学实验室完成。)
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