2. 北京理工大学生命学院, 北京 100081
2. School of Life Science, Beijing Insitute of Technology, Beijing 100081, China
1917年，Morgan等在果蝇体内首次发现Notch基因，该基因的部分功能缺失会导致果蝇的翅膀边缘缺刻；直到1983年才由Allman等[1]第1次克隆出Notch基因。Notch作为高度保守的信号通路，调控细胞增殖、分化和凋亡的过程，在许多组织和器官中发挥着重要的作用[2]。在细胞分化过程中，Notch的功能体现在4个方面：参与胚胎的发育，参与T细胞的发育，维持造血干细胞的自我更新以及调节血管的生成。随着中国糖尿病患者的增多，该病引起了人们的广泛关注和重视。糖尿病的危害主要在于其并发症，其中，血管病变是糖尿病重要并发症之一。Notch一方面影响机体血管的生成，另一方面调节体内的物质代谢[3]。许多研究已证明Notch信号通路的异常与糖尿病并发症密切相关，因此，本文主要从糖尿病及其并发症方面综述Notch通路的功能以及对前者的影响。
1 Notch信号途径 1.1 Notch信号通路的结构基础Notch是一种广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物中高度保守的信号转导通路。该通路由跨细胞膜的配体、受体及其下游信号分子组成，在调节细胞生理和病理过程中起着重要的作用。在哺乳动物中存在5种Notch的配体，包括Delta-like配体(Dll1、Dll3、Dll4)和Jagged配体(Jagged1、Jagged2)。这些配体均为单跨膜蛋白，并且存在着共同的结构特征：表皮生长因子重复序列、与Notch受体相结合所需的DSL(Delta,Serrate/Lag-2)区域和一个跨膜区域[4]。Notch通路中包括4种Notch受体(Notch1-Notch4)，分子质量约300 ku，它们的前体经细胞内质网合成后，转移至高尔基体，完成糖基化和岩藻糖基化后，再被Furin样酶切成两段，最后转运至细胞膜形成异源二聚体(Fig 1 S1) ；这些受体都是由细胞外区、跨膜区以及细胞内区所构成的Ⅰ型跨膜蛋白。Notch信号的主要效应分子有转录因子CSL和HES(hairy and enhancer of spite)。转录因子CSL是Notch信号通路重要成员之一，它在哺乳动物中称为CBF1，在果蝇中叫Suppressor of hairless，在线虫中又称为Lag-1，故被命名为CSL。HES为Notch信号的另一效应因子，在哺乳动物中共有6个成员，其中，Hes-1和Hes-5在Notch信号转导过程中起着不可或缺的作用。
1.2 Notch信号通路的激活机制Notch信号通路的激活是通过受体与配体结合启动的。配体同Notch受体相互作用使其构象发生改变，经过解聚素和金属蛋白酶(ADMA)水解掉细胞外结构域(Fig 1 S2)，再经多亚型膜蛋白酶γ-分泌酶进一步切割催化(Fig 1 S3)，将Notch水解后的细胞内结构域(notch intracellular domain,NICD)从细胞膜上释放出来[5]。NICD是Notch信号的活化形式并含有核定位信号，NICD释放后进入细胞核内，同CSL结合形成转录激活复合体，此复合物包含RBP-Jκ(recombinant signal binding protein 1 for Jκ)和 MAML 1(mastermind- like protein 1)。当NICD缺失时，RBP-Jκ结合到特异的基因序列，通过与组氨酸脱乙酸基酶和其他成分形成一个共同抑制转录的复合体，调节各种靶基因元件并抑制这些基因的转录，NICD入核后通过异位将RBP-Jκ与组氨酸脱乙酸基酶形成的共同抑制复合体置换，导致NICD靶基因Hes和Hey的转录激活(Fig 1)，进而影响细胞增殖、分化和凋亡。
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| Fig 1 Schematic representation of Notch signaling[5] During maturation and transport of the receptor to the membrane, Notch gets cleaved in the Golgi system at Site-1(S1) by a furin-like convertase, generating a heterodimeric transmembrane receptor. In the absence of ligand the receptor is proteolysis-resistant. Only upon binding of ligand, resulting in a substantial conformational change, the metalloprotease ADAM is able to cleave Notch at the newly exposed Site-2(S2). On the receptor-expressing cell S2 cleavage results in a NEXT fragment that is directly cleaved at the membrane at Val1744 by the γ-secretase complex(S3). NICD can translocate to the nucleus where it participates in a co-activator complex binding to CSL and start target gene transcription. |
Ⅰ型糖尿病(T1DM)是由胰岛β细胞受损导致胰岛素分泌不足而引起的疾病，可通过胰岛β细胞再生和移植治疗T1DM。此两种治疗方法都是基于对胰岛β细胞发育的调节和体内稳态相关信号通路的正确理解。
Notch通路与很多疾病的发生有关，包括肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等。在许多组织中，Notch信号通路的Hes(hairy enhancer of split)或Hey(hairy-related genes)已被确认为关键的靶基因。其中，Hes作为碱性螺旋-环-螺旋(bHLH，basic helix-loop-helix)蛋白转录抑制子，在许多器官发育过程中起着至关重要的作用，如在胰腺中，bHLH可调节其祖细胞增殖和发育过程[6]。Jensen等[7]发现，Hes-1缺陷可引起胰腺发育不全，可能是由于胰岛上皮细胞前体缺失导致胰腺内分泌细胞分化加快造成的。在一项体外研究中，利用基因沉默技术抑制Hes-1的表达能明显降低胰岛β细胞的增殖和去分化，揭示Notch信号通路与胰岛β细胞命运相关，Notch可能成为体外诱导胰岛β细胞再分化的潜在分子靶点[8]。
3 Notch与糖尿病并发症 3.1 糖尿病视网膜病变糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是晚期糖尿病常见眼部并发症。DR是临床上眼科常见的视网膜微血管病变，也是当今世界上眼疾致盲的主要诱因之一[9]。据统计全球约30%糖尿病(DM)患者患有DR；在9 300万DR患者中，有1 700万增殖性DR患者，2 100万糖尿病性黄斑水肿患者，2 800万DR患者视力受到威胁[10]。因此，DR在糖尿病治疗过程中不容忽视。
DR的临床特征主要是视网膜新生血管形成和血-视网膜屏障的破坏。DM引起DR的发病机制非常复杂，DM患者体内长时间的高血糖会导致机体内的炎症因子和细胞因子活化、氧化酶损伤以及微血管内血栓形成。造成DR主要原因有氧化应激、细胞内晚期糖基化终末产物(AGEs)大量堆积和PKC通路的激活等。
DR新生血管的异常增殖受多种因素的影响。在Notch信号通路中，Delta样配体4(Dll-4)与Notch受体1(Notch1)是影响新生血管生长的重要因子，Dll-4是Notch-1的配体，在生理条件下，对血管生成、成熟等起到重要作用。Dll-4/Notch通路通过调节血管收缩和血流来调控新生血管的重构和退化[11]。小鼠胚胎Dll-4基因突变后，胚胎内血管发育严重畸形，揭示了Dll-4对血管分化、成熟同样具有重要的调节作用。血管内皮的Dll-4被抑制后，其血管生成明显增加，且血管壁薄、管腔扁平，阻碍血液顺畅流动。除此之外，血管内皮生长因子(VEGF)也是促进DM患者视网膜新生血管生成的重要因子之一[12]，参与血管生成的许多环节，包括改变内皮细胞基因的激活状态、促进内皮细胞增殖、提高血浆酶原活化因子的活性，最终形成新生血管。研究发现，在DR患者眼内液VEGF水平与DR进展和糖尿病眼底病变程度息息相关。增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)患者的眼内液中VEGF水平明显增高，是对照组的17倍[13]。在STZ诱导PDR小鼠的血清和玻璃体中VEGF及其受体都升高[14]。Nakao[15]认为对PDR进行抗VEGF治疗，可以达到抗炎、促进血管收缩和成熟的疗效，进而解决视网膜水肿的问题。许多研究已证实，Notch信号转导与VEGF有密切关系，两者共同调节DR血管的异常增殖。Dll-4经VEGF诱导后可作为负反馈调节因子发挥抑制血管过度发芽式增殖的作用。端细胞是一种血管内皮细胞，其生成和发芽是血管生成的第一步；多年研究发现，在DR患者和动物模型的新生血管中存在大量的内皮端细胞，VEGF可以调节端细胞的迁移和发芽，并使细胞外基质(ECM)溶解，VEGF-DLL-Notch通过介导外膜细胞招募进而影响新生血管的生成[16]。
Notch信号通路在视网膜发育及新生血管增殖过程中均扮演着重要的角色，是治疗DR的潜在靶点，但其具体的作用机制尚未明确，尤其在DR中，有待进一步深入研究。
3.2 糖尿病肾病糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)为DM常见小血管病变造成的并发症，可引起终末期慢性肾功能衰竭；其主要病理特征有：细胞外基质堆积、肾小球硬化及基底膜增厚、肾间质纤维化和肾小管的萎缩等。近几年研究发现，DN的发生、发展过程与Notch有密切关系[17]；Notch信号通路参与肾脏的发育、肾小球病变、肾小管间质纤维化以及微血管病变，进而影响DN的发生发展。
Notch通路决定着胚胎的发育和细胞的增殖、分化，在肾脏足细胞的分化中也起着重要的作用。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞，附着在肾小球基底膜外侧，是肾小球滤过膜的重要成员。高度分化的足细胞增殖能力较差，足细胞损伤会导致肾小球滤过能力下降，从而引起蛋白尿的产生。Notch信号与足细胞凋亡有密切的关系。高糖诱导足细胞凋亡被认为是DN进展过程中的关键因素。Kim等[18]发现，高糖诱导大鼠足细胞凋亡，上调Notch 1、Jagged-1的表达和提高Hes转录的活性，同时降低辅助因子相关的精氨酸甲基转移酶1(CARM1)活性。足细胞瞬时转染CARM1可以逆转高糖诱导足细胞Notch 1和Hes的高表达以及足细胞的凋亡；糖尿病足细胞中泛素依赖的CARM1降解可引起Notch1表达上调促进足细胞凋亡。机制研究表明，高糖激活Notch信号通路诱导足细胞凋亡与抑制PI3K/Akt通路相关，反之，激活PI3K/Akt通路亦可抑制Notch信号通路从而抑制足细胞的凋亡；在DN发生时平衡Notch和PI3K/Akt信号转导尤为重要[19]。高糖激活足细胞Notch信号通路除了对PI3K/Akt通路有影响外，还可通过介导Bcl-2和p53凋亡通路促进足细胞凋亡[20]。
Notch信号通路的激活会加重糖尿病肾小球病变，糖尿病肾脏疾病(DKD)主要病变包括肾小球基底膜变厚和系膜扩张。高糖诱导肾小球系膜细胞(GMCs)可激活Notch信号转导，进一步诱导TGF-β信号转导，加重糖尿病肾病纤维化[21]。同时，Smad3信号转导、非典型的PI3K/Akt和ERK串扰可以促进TGF-β1上调Notch信号通路中Jagged的表达。在成熟足细胞内不断激活NICD表达可引起足细胞的去分化、肾小球硬化和凋亡，导致蛋白尿和肾衰。如果用γ-分泌酶抑制剂可以减少肾小球中Notch靶基因的表达，抑制VEGF病理性表达，阻止DM诱导的肾小球硬化和足细胞凋亡。因此，抑制肾小球上皮细胞上Notch信号通路的过度激活可能会成为治疗DN的有效方法。
糖尿病肾小球病变出现在DN的早期，肾小管间质纤维化是终末期肾病进展或者加重的典型特征。肾小管上皮细胞发育需要Notch的参与，然而在DN患者中，肾小管上皮细胞有时会出现Notch信号通路病理性再激活，可能是由TGF-β诱导Jagged1 过表达造成的[22]。体外研究显示，无论是在人还是鼠源的肾小管上皮细胞上，Notch通路可以介导TGF-β促进上皮细胞向间质细胞转变；但体内环境可能更复杂，不断激活NICD使其过表达，不能诱导上皮细胞向间质细胞转变，却会增加Notch的靶基因Hey1的表达。肾小管上皮细胞中Notch信号转导加重肾小管外周炎性细胞的浸润及促进间质纤维细胞的增殖，最终导致间质纤维化。
无论是肾小球硬化病变、肾小管间质纤维化还是肾脏毛细血管病变都涉及到Notch信号通路的激活。因此，抑制糖尿病患者肾脏中Notch分子的过度激活可能会成为治疗DN有效靶点。
3.3 糖尿病心肌病糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一种独立于冠状动脉疾病和高血压的心肌结构和功能改变的疾病，DCM是导致糖尿病患者心脏舒张功能紊乱和心衰的主要诱因[23]。DCM主要病理特征有心肌肥大和心肌纤维化。DCM发病机制复杂，高血糖是诱发DCM的关键因素，它可引起代谢失调、氧化应激、信号通路的活性异常，进一步导致心肌结构适应性病变，心室舒张和收缩功能障碍。
Notch信号在心脏胚胎发育期参与了心肌的分化调节，Notch可以介导心脏房室沟、瓣膜、流出道和肌小梁的形成，该通路中的关键元件突变可引起严重的先天性心脏病[24]，同时，Notch信号激活可以促进心肌再生保护心肌损伤。Jagged1可以激活Notch1 进而增强心肌细胞增殖能力，当Jagged 1基因沉默时可以缓解这种增强效应[25]。Notch1 信号转导在心肌干细胞增殖和分化过程中起着重要的作用，当以γ-分泌酶抑制剂阻断Notch 通路时，可以使肌细胞减少62%、心肌细胞数量减少54%，引起致命性扩张性心肌病[26]。未成熟心肌细胞内含高水平的Notch 1和 Jagged 1不但可以预防未成熟心肌细胞凋亡，还可以明显促进其增殖。在心肌肥大的心脏中，上调Notch 1能调控心脏对应激的适应性反应，这种作用不仅仅局限于调控肥厚性反应的程度，还可以维持心肌细胞的存活。除此之外，Notch一方面能抑制心肌祖细胞分化，另一方面还能控制心肌细胞增殖、降低间质纤维化。DCM公认的发病机制之一为体内长期的高血糖引起心脏持续地氧化应激(oxidative stress)，导致患者心脏适应性重构，出现心肌肥大和纤维化，引起心脏功能改变(左心室舒张和收缩功能减退)，最终引起心衰甚至死亡。这与Notch信号调控心肌适应性重构有密切的关系，Toubin等[27]认为扰乱Notch信号可引起左心室肥大(LVNC)。Notch下游基因Hes1、Hey1和Hey2的下调可激活心脏基因表达并加重心肌肥大。Hey基因，尤其是Hey2 可以抑制心脏内基因转录，该基因直接与心肌转录因子(GATA4)相互作用抑制心肌肥大。因此，Notch通路是通过负调节心脏转录基因来发挥抑制心肌肥大的作用。心房基因的再表达，如心钠素的表达，是心肌肥大的重要特征并影响心脏的功能。当Notch1缺失时，心肌细胞基因表达被激活并出现心肌肥厚。在缺少Notch1的心脏中，当血液动力学超负荷时心肌细胞凋亡明显增加。Notch分子不仅在正常的心脏中发挥保护作用，还能够保护缺血/再灌注引起的氧化应激对心脏的损伤[28]；它可以与肝细胞生长因子及其同源受体c-Met、PI3K/Akt信号通路相互作用保护心肌细胞[29]。总之，Notch通路在心脏中扮演着重要的角色，无论是对前期心肌细胞发育的影响，还是对后期氧化应激引起的病理性心肌重构(心肌肥大和纤维化)的保护作用，都涉及到Notch通路中关键元件的激活。调节Notch通路可能会是一种限制左心室重构以及相关心功能降低的有效方法[30]。
尽管至今还没有直接的研究表明Notch通路在糖尿病心肌病中的重要作用，但不代表两者没有关系，相信未来会有研究填补这一空白进而阐明Notch信号转导与糖尿病心肌病的密切关系。
4 结语与展望综上所述，糖尿病及其心血管并发症与Notch信号通路有着密不可分的关系，在不同的并发症中该通路的状态也不同，在受损的胰岛β细胞、糖尿病视网膜病变和糖尿病心肌病中Notch通路的关键元件被抑制，可能为其配体，也可能为其细胞内效应基因；相反，Notch通路在糖尿病肾病中被过度激活。因此，在不同的糖尿病并发症中有效地调节Notch通路可能会成为热点研究。首先，可以通过靶向技术，如纳米技术将Notch通路激活剂靶向运输至胰岛或心脏中，使Notch 信号分子在胰岛、视网膜或心脏中高表达，而对其他组织的该通路无影响，从而降低该药物的副作用。其次，为克服Notch在糖尿病肾病中的高表达，选择性抑制Notch通路信号转导中关键酶γ-分泌酶，从而缓解糖尿病肾病。
Notch信号通路在糖尿病引起并发症中相关研究还未被完全阐明。但从前期研究来看，Notch信号通路与糖尿病有着密不可分的关系，在临床上除了降糖维持治疗以外，没有专属药物治疗其并发症。并且，Notch通路激活剂与格列本脲、二甲双胍和阿卡波糖等降糖药物联合用药是否能够增加其疗效，都值得深入研究。尽管Notch信号在糖尿病并发症研究不够深入，包括Notch通路与不同并发症的作用机制尚未明确，Notch激活剂或者关键酶抑制剂的靶向剂型的研究不够深入，这也为我们的研究提供了新的思路和明确的方向；因此，Notch可能会成为潜在的有效靶点，开发出治疗DCM、DR和DN的新药。相信人们在同糖尿病的长期战役中会取得最终的胜利。
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