2. 天津中医药大学, 天津 300193;
3. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所, 北京 100050
2. Tianjin University of Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;
3. Institute of Material Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Parkin在1998年被日本Kitada学者研究青少年型帕金森疾病(autosomal recessive juvenile parkinson，AR-JP)时发现并提出，并且作为常染色隐性遗传基因被证实与帕金森疾病(Parkinson′s disease，PD)的发病相关，又因属于PARK家族，故被命名为RARK2。通过不断深入的探索研究不仅发现Parkin是青少年型帕金森疾病的主要致病因素之一，而且在排查诸多肿瘤和白血病患者的基因时发现高比例的Parkin异常，表明Parkin与肿瘤及白血病的发生发展存在着一定的关联。
1 Parkin简介Parkin位于第6号染色体上，全长q25.2~q27的区域约为1.5 Mb，编码了465个氨基酸。Parkin蛋白有52 ku，在大脑、肝脏、心脏、肾上腺等细胞中均能被检测，多集中在胞质，也有在线粒体外膜和高尔基体等细胞器上分布。
Parkin蛋白的结构在C端有着典型的RBR(RING1-IBR-RING2)结构，RING1和RING2是环指结构，IBR(in between RING)结构夹在两个环指结构之间，并且富含半胱氨酸(Cysteine,Cys)。Parkin蛋白连接有8个锌离子，在RBR区域中，RING1、IBR和RING2各连接有2个锌离子，每个锌离子连接4个氨基酸并使蛋白折叠成一定结构；在RING1上游的RING0区域也连接有2个锌离子。蛋白的N端有一个类泛素结构区(the Ubiqition-like，Ubl)，其中有76个氨基酸与泛素同源，存在泛素折叠并且有泛素结构活性，因此认为Parkin蛋白作为E3泛素连接酶参与泛素-蛋白体酶系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)的相关活动。UPS在真核生物体内普遍存在，通过对错误蛋白质的降解，在体内能调控蛋白质的水平，对细胞的新陈代谢起着重要作用。Parkin蛋白作为E3连接酶，能将E2结合酶传递的底物泛素化，并将泛素化的底物进一步呈递给蛋白体酶，通过蛋白体酶作用降解成小分子物质，供细胞内物质循环再利用。
2 Parkin与帕金森PD发病率仅次于阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)，是一种常见的神经退行性疾病[1]。PD常在老年发作，黑质多巴胺能神经元逐渐变性和缺失、路易小体(Lewy body，LB)缓慢形成是其病理特征。PD的发病原因复杂，常由遗传、环境和年龄等因素单独或相互作用导致。在家族性PD的发病机制中，大量研究已经证实，α-synuclein、DJ-1、PARK 1~13等基因与PD的发病相关，而散发性PD的发病常认为和环境存在很大关联。在研究Parkin与PD发病的相关机制时，发现Parkin自身不仅对PD有所影响，通过和其他反应物的相互作用也可以导致PD的发病。
2.1 Parkin单独作用Parkin基因有12个外显子，在正常表达时能维护细胞的正常生理功能，保护细胞结构不受破坏。通过诸多调查研究发现，不仅在AR-JP患者中，其他PD类型中，Parkin基因外显子突变和缺失的比例也均显示偏高，这表明Parkin基因外显子突变可能直接导致PD的发病。Parkin的突变对其蛋白降解也会有所影响，已有研究表明，SynucleinA53T与synucleinE46K可通过不同信号通路发生自噬或泛素化现象。此外，Parkin与氧化应激、线粒体稳态、蛋白质周转代谢、异源吞噬、新陈代谢等细胞生长增殖相关的过程的功能相关[2]。Parkin自身功能以及相联系的其他功能的异常，与PD患者体内正常的生理状态失衡有密切联系。
2.2 Parkin与其他反应物对PD的影响Parkin由于自身结构的特异性，通过与物质直接结合或者作为反应物参与UPS等途径过程可以调控细胞内的物质基础和结构功能。当Parkin发生突变时，正常的生理平衡状态被破坏，细胞内的结构功能异常导致底物或损伤的细胞器无法降解从而致使聚集物的形成，甚至细胞死亡。
Parkin的蛋白底物通过与Parkin结合，并在一定的条件下反应，对维持细胞的正常生理有着重要意义。已知的Parkin 蛋白底物包括α-Synuclein、Pael-R(Parkin-associated endothelin receptor-like receptor)、SytXI(synaptotagmin XI)、αSp22、α/β-Tubulin、细胞凋零素E(Cyclin E)、SIM2(human single-minded 2)、细胞周期调控相关蛋白1(cell division control-related protein 1，CDCrel-1)等。在Parkin的研究过程中发现，在正常对照组脑内没有检测到蛋白底物αSp22和Pael-R等的存在，而在PD患者脑内这些物质却大量存在[3, 4]，这为蛋白底物诱导PD的发病提供了一定依据。
PARK6，又称PINK1(PTEN induced putative kinase 1)，和PAKRIN均属于PARK家族，是PD相关基因之一。线粒体作为人体主要供能的细胞质，对细胞的生长发育起着举足轻重的作用。当线粒体异常时，可能导致体内Ca离子超载、氧化应激和能量代谢失常等反应，从而引发包括神经元在内的细胞损伤，促进PD等神经性疾病的产生。Parkin蛋白可以通过诱导细胞色素C使异常的线粒体自噬以维持线粒体的正常运转，通过直接与线粒体的DNA结合以减轻ROS损伤以及促进线粒体DNA的修复，还可以在细胞分裂中与线粒体嵴上的转录因子A结合，增强线粒体的活性。Parkin/PINK1途径在主要作用在神经元轴突末梢，损伤的线粒体也在神经元轴突末梢在Parkin/PINK协调作用下自噬，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径，可以高效选择受损的线粒体清除，并促进线粒体的增殖以维持线粒体的正常生理功能。因此，PINK1/Parkin通过对线粒体的调控对PD的疾病有极大的相关性。除底物蛋白和PINK1之外，LRRK2、BAG5等均能和Parkin发生反应，并且还能促进PD的病理性产物LB的形成[5]。LRRK2可以和Parkin共同调控线粒体的功能；BAG5在黑质区的过表达则会增加损伤的的神经元中mRNA和蛋白质的生成，促进PD的发展。
3 Parkin与癌症 3.1 抑癌基因-Parkin许多肿瘤的产生与体内染色体区域片段丢失变性相关，如p53、Rb片段和脆性位点(Fragile site)等。脆性位点是染色体上不稳定区域，并在外界刺激下容易发生突变，可以促使正常细胞癌变。Parkin区域有着CFS(common fragile site)区域，在6q26区间包含着FRA6E脆性位点。Parkin基因所在6q25-q27区域的杂合性染色体丢失与各类乳腺癌、卵巢癌、肺癌等固态瘤密切相关。近年来，随着对Parkin研究的深入，由于Parkin基因位点的特殊性以及在E3泛素连接酶和线粒体中的相关作用，研究发现，Parkin的过表达可以抑制肿瘤细胞和癌细胞的增殖，而Parkin失活则会促进肿瘤细胞和癌细胞的增殖生成，证明了Parkin在体内作为一种抑癌基因，可以减轻肿瘤细胞的增殖生长。
3.2 癌症及其诱发机制Parkin被作为一种抑癌基因，通过PCR(polymerase chain reaction)、Western blot、NGS(next generation sequencing)等方法，在检测诸多癌症患者的基因中均发现异常的Parkin及其表达，其中包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、直肠癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌以及急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病等。
在病情发作的过程中，检测到的Parkin异常包括基因突变、mRNA高(或低)表达、蛋白的低表达、启动子甲基化、转录异常、脆性位点基因断裂等情况[6]。基因突变、mRNA低表达和编码丢失在多种癌症患者体内均有发现。运用PCR检测胰腺癌的相关基因中，mRNA低表达和编码丢失率高达100%。
3.2.1 肝癌Parkin的丢失可以促进肝细胞增殖和抑制细胞凋亡，并通过增加内源性卵泡抑素，导致肝癌的产生[7]。在Parkin基因表达缺失的肝癌细胞株Huh-7中，转染野生型和突变型的Parkin后，Parkin的mRNA表达均有上调，但突变型的Parkin对肝癌细胞无明显作用，野生型的Parkin则能抑制肝癌细胞的增殖。GPR37(G protein-coupled receptor 37)是Parkin作用底物Pael-R家族成员之一，在癌症的发生发展中起着重要作用[8]。与相邻非肿瘤组织相对比显示在肝癌细胞中GPR37的比例偏低，在血清饥饿培养的Huh-7中GPR37的表达减少，这表明缺失或者减少GPR37的表达都会导致肝癌患者的预后不良。在Huh-7细胞中，GPR37在被siRNA敲除后可以通过活化PI3-K/Akt信号传导途径明显降低肝癌细胞凋亡。Parkin可能通过调控GPR37的表达水平，从而影响肝癌的发生发展。
3.2.2 乳腺癌在Parkin缺失的乳腺癌细胞中转染Parkin基因，能明显降低癌细胞的增殖速度以及减轻癌细胞的扩散能力。CDK6(cyclin-dependent kinase 6)能抑制乳腺癌细胞的增殖。Parkin在乳腺癌细胞中表达时，CDK6水平明显增加，并和Parkin的表达呈一定线性比例[9]。泛素连接酶Nrdp1(Neuregulin receptor degradation protein 1)可以泛素化包括Parkin在内的诸多底物，研究显示，Nrdp1的缺失可以促进乳腺癌的增长[10]，这可能与Parkin的异常，造成UPS无法正常运行有关。在乳腺癌的放射性治疗过程中，线粒体自噬在维持缺氧诱导的抗辐射中起到了重要作用。通过和Parkin的相互作用，p53可以抑制Parkin转移到线粒体上，从而阻断对线粒体自噬的保护。过表达的Parkin可以减轻TAT-ODD-p53抑制的线粒体自噬，也可在低氧条件下降低p53引起的线粒体自噬功能[11]。Parkin还可以通过微管依赖性机制来调节乳腺癌化疗药物紫杉醇的敏感度。
3.2.3 肺癌由慢病毒载体介导的野生型Parkin基因在导入小鼠H-460肺癌细胞后将抑制肿瘤细胞的增长。利用Western blot技术，可以检测到石蜡包埋肺癌细胞样品的Parkin亚型表达谱。在蛋白体酶抑制剂、线粒体去极化剂和血清饥饿等的条件下对肺癌细胞和正常支气管上皮细胞系进行分析，得出Parkin的H1/H5、H14、H 4/H8/H17、H3/H12亚型均在人肺癌细胞中表达,并且在治疗后表达有所改变。人体肺癌细胞表达了不同的Parkin亚型，这表明不同的亚型可能作为恶性肿瘤的标记物并起着特定的生理功能[12]。
3.2.4 胃癌在测定胃癌患者的Parkin基因中发现，Parkin的异常主要集中在基因突变和编码丢失，其中基因突变的比例为4.6%，而编码丢失则高达11.6%。LRPPRC(Leucine-rich PPR-motif containing protein)可以作为线粒体自噬降解和肿瘤形成的特征物质。在胃癌中，LRPPRC水平升高表明患者的总生存期减短。LRPPRC可以和Beclin 1和Bcl-2形成三元络合物并且明显抑制细胞自噬，还可以通过Parkin单泛素化Bcl-2以增加Bcl-2的自噬稳定性。在线粒体自噬时，Parkin转位到线粒体上，在使线粒体外膜破裂后，和暴露的LRPPRC结合。LRPPRC和Parkin随着线粒体的消失而不断消耗，最终在ATG5-ATG12偶联物的作用下自噬失活[13]。
3.2.5 结肠癌在结肠癌患者的体内检测，约有42%突变型Parkin，并且突变大量聚集在外显子3~6上。野生型Parkin可以诱导Cyclin E蛋白降解，而突变型的Parkin则对Cyclin E蛋白降解无明显效果。研究证明[14]，Parkin可以通过调控Cyclin E蛋白水平，对结肠细胞的细胞生长周期进行调节。表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)可以刺激结肠细胞的Parkin基因使其表达上调，而PI3-K/Akt依赖性途径的抑制可以使生长因子引诱的Parkin表达减弱，这表明结肠细胞的Parkin的表达与生长因子的刺激诱导和PI3K/Akt信号通道相关。Parkin和APC(adenomatous polyposis coli)的联合缺失可以促进结肠癌的发生，研究证明[15],Parkin杂合子敲除的小鼠和APC-Min小鼠杂交可以增加息肉水平和加速结肠癌的发生。
3.2.6 子宫内膜癌PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome TEN)是一种抑癌基因，通过去磷酸化参与细胞调控[16]，也可以通过PTEN水平判定肿瘤发展及预后情况。由PTEN引起的Ser/Thr激酶PINK1(PTEN Induced putative Kinase 1)可以和Parkin形成PINK1/Parkin通道来参与线粒体的自噬。Akt又称PKB(protein kinase B)，在诸多的肿瘤组织中均呈现其过度表达，它磷酸化的诸多底物对细胞生殖生长有着重要作用。PI3K/Akt信号通道可以促进细胞的增殖，而在肿瘤细胞的异常激活则可能导致癌细胞和血管的生成。
根据国际公认的“二元论”原理，将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型多数为内膜样癌，约占子宫内膜癌发病率的85%；Ⅱ型发病时间比Ⅰ型晚10年左右，以浆液性癌为主。对子宫内膜癌Ⅱ型患者和正常对照均采用RT-PCR和Western blot技术测定来PTEN和PI3-K/Akt信号通道发现，PTEN的mRNA和蛋白表达量均低于正常对照组，而PTEN缺失的组别内Akt磷酸化水平升高，并呈现负相关关系[17]。这表明PTEN缺失是子宫内膜癌的诱因之一，而PTEN缺失诱导的Akt磷酸化则促进癌症的发展。
3.2.7 卵巢癌用RT-PCR技术分析102对卵巢癌和正常对照样本的Parkin杂合子缺失和表达异常时，发现基因内标物D6S1599在杂合子缺失中所占比例最高，为53%；而在检测Parkin异常表示中发现48%的Parkin表达沉默[18]。在对卵巢受损的母猴治疗时，发现Parkin表达增加可以明显提高雌激素、雌激素黄体酮合并治疗的效果，此外PCNA((proliferating cell nuclear antigen)、Hsp70(heat-shock protein 70)、SCNA(α-synuclein)等与Parkin可结合反应的物质也有相似效果[19]。PCNA在S期大量表达并可以依据PCNA的表达情况来判断肿瘤预后水平，Hsp70可以保护细胞、减少损伤，SCNA区域的α-synuclein对细胞凋亡有保护作用。
3.2.8 胰腺癌经过临床病理学分析，Parkin的表达和胰腺癌的发生呈负相关，并可以判断胰腺癌的恶性程度。在胰腺癌患者中，均呈现Parkin基因的表达下降或者编码缺失。Parkin的表达与在胰腺癌细胞分裂周期密切相关。在细胞分裂间期，Parkin被检测到主要分布在细胞核附近，而在有丝分裂期则主要分布在中心体和纺锤体附近，并且在分裂时纺锤体上也有存在。Parkin的缺失可以增加纺锤体多极化和多核的比例，在主轴的取向偏差上也有所增加。当Parkin表达沉默可以促进胰腺癌细胞的增殖和致癌性[20]。
3.2.9 白血病在研究白血病患者体内Parkin异常时发现，26%急性粒细胞白血病(ALL)和3%慢性粒细胞白血病(CML)的患者体内Parkin启动子出现甲基化。研究表明Parkin和PINK-1、DJ-1等基因的相互作用对白血病也有一定影响[21]。鱼藤酮对细胞内线粒体、NADH脱氢酶等有一定抑制作用，可以诱导多种癌细胞凋亡。在Jurkat细胞中，鱼藤酮可以诱导Parkin表达增加和DJ-1细胞质聚集体的生成，但对PINK-1没有影响[22]。
4 讨论PARKIN作为帕金森疾病致病相关基因之一，其表达产物Parkin蛋白作为E3连接酶在泛素-蛋白体酶系统参与蛋白质的降解过程，与其他相关物质的相互作用也可以促进帕金森疾病的相关发生发展。近年来在研究肿瘤时发现，Parkin在肝癌、胃癌、乳腺癌等诸多恶性肿瘤中均出现基因及表达异常的现象。Parkin及其表达的完整度和癌症的发病率呈现负相关性，可以通过Parkin的水平来判断癌症的预后情况。Parkin作为一种抑癌基因，目前其抑癌机制尚不明确，Parkin基因断裂、编码丢失、启动子甲基化等突变导致癌细胞机制变化的机制也还在研究之中，通过对Parkin在癌症方向的深入研究发展，发现其致病因素以及防治方案，将对今后的癌症预防治疗过程大有裨益。
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