2. 中国中医科学院 心血管病研究所, 北京 100091
2. China Heart Institute of Chinese Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)在人群中具有较高的患病率[1]，被认为是心血管疾病的独立危险因素[2, 3]，它能够增加高血压、脑卒中、冠心病、心力衰竭及心源性猝死等心脑血管疾病及事件的风险[4, 5, 6]，因而其与心血管病关系近年来日益受到研究者的关注。OSAHS以慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)为核心病理特征，表现为睡眠中长期并反复出现缺氧-复氧，CIH是OSAHS导致心脑血管并发症的主要因素。针对这一核心特征，近年来，许多研究以动物为实验对象，通过手术控制动物气道通气或体外调节动物呼吸的环境气体氧浓度等方法，模拟间歇性低氧条件以实现反复的缺氧-复氧过程来模拟人类OSAHS的表现，因此，建立间歇性低氧动物模型是研究OSAHS相关疾病的重要方法。
近20年来，对于CIH相关心血管疾病的动物实验研究众多，造模方法不一，选材及处理条件各不相同，尚无公认的动物模型。通过检索近年来研究CIH相关心血管疾病及CIH对心血管病常见危险因素影响的文献，本文将对其中慢性间歇性低氧动物模型的建立方法进行归纳整理，并探讨其规律，以求为OSAHS相关心血管疾病的动物实验研究提供参考。
1 实验动物的选择 1.1 动物的种类OSAHS模型动物种类繁多，早期研究常采用大型哺乳动物，如英国斗牛犬[7]、小型猪[8, 9]等，而近年用于CIH相关心血管疾病研究的动物模型以啮齿类动物为主，主要包括大鼠、小鼠。其中大鼠又包括Sprague Dawley(SD)大鼠[10]、Wistar大鼠[11]等，小鼠常用C57BL/6J小鼠[12, 13]等，其他研究者也曾选用豚鼠[14]，非啮齿类动物如新西兰大耳白兔[15]等。
在这些分类的基础上，根据不同实验研究的需求，特别是以某一信号通路或某种特定疾病为具体研究内容的实验中，基因敲除动物、突变系动物及自发性疾病动物的应用也非常广泛。基因敲除动物最多见的是载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠，最常用于动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)相关的研究中[16, 17]；又如在一项关于缺氧相关炎症反应中核转录因子kappa B(NF-κB)作用的研究中，应用了敲除NF-κB抑制蛋白IκB的激酶IKK-β的小鼠[18]。常用突变系动物如肥胖自发突变的纯合子小鼠(ob/ob小鼠)，它常被用于间歇性低氧相关肥胖及血脂代谢异常研究[19]。自发性疾病动物以自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat,SHR)[20]为代表，主要用于间歇性低氧合并高血压的研究。
纵观目前间歇性低氧动物研究，大鼠、小鼠仍为主要的模型动物，究其原因，主要源于它们的昼夜习性规律，昼伏而夜动，睡眠时间与人的工作时间较吻合，适于睡眠疾病的研究。另外，考虑造模过程中动物缺氧箱等设备的空间需求，大鼠、小鼠体积较小，更方便操作。
1.2 动物的其他特性选定某种动物为研究对象后，其他如性别、周龄等生物学特性也需纳入考虑范围。但从目前的众多研究来看，这些特性的选择与其他各种常见心血管疾病的模型动物并无差异。
在动物性别的选择上，多数研究倾向于选用♂动物[21]，以尽量避免激素分泌水平、妊娠等因素的干扰。而在对比性别间差异或其他特殊情况下也会选用♀动物，如曾有研究[22]观察了间歇性低氧条件下♀、♂ SD大鼠间血压变化差异，结果提示两种性别大鼠在间歇性低氧条件下都会产生血压升高的效应，但♀大鼠血压升高水平低于♂及卵巢切除术后的♀大鼠；近年又有研究者[23]对比了间歇性低氧对不同性别C57BL/6J小鼠间血管壁蛋白表达影响的差异，发现♀与♂小鼠相比，20种蛋白表达上调，14种蛋白表达下调，其中上调的蛋白中包括了APOA-4等血脂代谢相关蛋白，而下调的蛋白以NACHT等炎症相关蛋白为主。再如一项研究间歇性低氧对机体瘦素分泌影响的研究中，也选用了瘦素水平较高的♀小鼠以便于指标检测及比较[24]。
在周龄的选择上多选用成年动物，大鼠多选用8~10周龄[25, 26]，而小鼠通常选择7~12周龄[12, 16]。在某些对特殊年龄人群间歇性低氧的研究中也有例外，如在一项建立儿童OSAHS间歇性低氧动物模型的研究中就采用了仅有25d龄的SD大鼠[27]；另有一项比较慢性间歇性低压低氧对于成年和幼年大鼠缺血/再灌注心脏保护作用研究中，选择新生大鼠作为观察对象，结果提示幼年大鼠更易对低氧耐受[28]。
2 气体控制仪器的选择在模拟间歇性低氧条件的气体控制仪器选择方面，不同研究之间差别较大。部分研究者从相关的仪器公司购买专用于动物低氧研究的成品仪器，也有部分研究者则选择自制仪器或相应的替代产品。
专用于低氧动物实验的气体控制仪器的优点是能够通过计算机编程预设所需的不同氧浓度，自动选择注入氧气提高氧浓度或注入其他气体降低氧浓度，控制条件较准确、处理条件相对稳定；并具备数据记录、实时显示和遥控等功能。这种气体控制仪器通常配有相应的缺氧动物箱以适应和保证调控气体浓度的要求，并配有相应的氧浓度检测装置。典型的仪器例如OxyCyler model A84 system[29, 30, 31]，产自美国Biospherix公司。也有许多实验室及研究者选择与成品仪器功能类似的其他低氧设备，同时使用配套的或自制的缺氧动物箱[32]，多数发表论文中对这种仪器描述欠具体。也有少数研究不使用缺氧动物箱，而使用改装的动物鼻面罩通入缺氧及复氧气体[33]。
虽然气体控制仪器各种各样，但是其原理相似。这些仪器都需要配备密闭的缺氧箱、氧浓度检测装置等必要组件，事实上，只要能够实现较为迅速的气体转换、保持实验需要的稳定的气体浓度即可。
3 气体种类及浓度的选择 3.1 缺氧及复氧气体实验过程中，制造低氧环境多选用通入氮气[12, 19]以迅速降低氧浓度，也有少数研究选用氮气与二氧化碳的混合气体[34]。而对于复氧气体的选择，则有氧气[35, 36]、空气[19, 37]等不同。此外，尚有研究[28]将氮气与氧气进行2种不同比例混合，分别使其氧浓度为最低氧浓度与常氧浓度，分别用于低氧条件及常氧条件的模拟。
目前尚无明确证据表明氮气或混合缺氧气体对模型动物有何不同影响，目前的研究多关注于造模所需的最低氧浓度，对于氮气、氧气、二氧化碳等常规缺氧及复氧气体种类的选择则缺乏明确的解释。
3.2 最低氧浓度常氧条件均与空气氧浓度近似，约为20.9%；但文献所示最低氧浓度的范围则较大，通常在5%~10%之间。如Del Rio R等[38]在颈动脉体对间歇性低氧的化学反射的研究中，就将最低氧浓度设置为5%，而在一项研究间歇性低氧对高血压影响的研究中最低氧浓度则设定为10%[22]。部分间歇性低氧动物研究中的最低氧浓度并非一个固定值，而是一个较小的范围，如一项关于CIH与AS的研究中最低氧浓度设定在6.0%~6.5%范围内[39]。
在间歇性低氧的干预下，不同研究中所形成的疾病终点或病理终点有血压变化、AS、炎症反应、细胞凋亡或损伤等不同。在证明不同最低氧浓度在形成这些终点间的差异方面文献报道较匮乏，曾有学者[40]比较最低氧浓度分别为5%、7.5%、10%条件下间歇性低氧对大鼠血清白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)水平的影响，发现最低氧浓度为5%时比为10%时IL-8水平高(P＜0.05)，说明了不同最低氧浓度间歇性低氧对炎症反应的影响不同；但总体来说目前仍无研究为最低氧浓度的选择提供确切、有力的证据。比较实验目的相似却选择不同最低氧浓度的研究来看，在5%~10%范围内，造模结果差异并不明显，已发表文献中鲜有介绍最低氧浓度选择依据者，而同一研究者或同一研究团队常选用相同的最低氧浓度[38, 41]。考虑研究者之所以选择不同，可能与经验、仪器条件限制等因素有关。
4 间歇性低氧处理时间的选择为了更近似地模拟人的慢性睡眠呼吸暂停过程，需要每日重复间歇性低氧操作、连续处理实验动物一段时间，并尽量与动物的睡眠时间吻合。
4.1 连续处理天数这是不同研究造模的主要差别之一，根据文献可见研究处理天数多在28 d(4周)~84 d(12周)之间[35, 42, 43, 44]。有研究者[45]模拟CIH条件连续处理C57BL/5J小鼠12周，在合并高胆固醇饮食条件下，发现与正常氧相比，间歇性低氧干预可导致胰岛素敏感性下降、糖脂代谢异常及AS改变。同样是CIH相关AS研究，有学者[35]将ApoE基因敲除小鼠分别暴露于CIH环境4周和12周，结果显示实验性CIH暴露无论是在第4周还是在第12周均可以明显促进小鼠主动脉AS斑块的形成，同时观察到4周时小鼠的收缩压升高，12周时舒张压亦升高。
也有少数间歇性低氧研究的缺氧处理时间明显长于12周或短于4周。如另有一项观察NF-κB激活对CIH相关主动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用研究中，研究者采用了较长了处理周期，共计20周(140 d)，结果提示CIH合并高脂饮食可引起血管壁炎症反应和明显的AS斑块形成，在这一过程中NF-κB的激活是重要的机制[39]。而研究间歇性低氧对血压水平影响的众多研究中，处理周期则较短，常为14 d[46]，尚有短至7 d者[22]。
分析处理天数不同的原因，可能与以下几个因素相关：① 目标心血管疾病模型的要求：根据目前文献报道，间歇性低氧处理较短时间可见血压升高[47]、炎症反应增强[38]、细胞凋亡加速[48]等效应，而处理时间较长除上述效应外较多的研究观察到血脂异常[19]、血管内皮损伤及AS形成[35]等。但目前尚无较完备的研究为这种效应的演变提供明确的依据，有待进一步探索。② 动物本身特性的不同：通过比较部分研究可见，健康动物对缺氧的耐受力可能强于一些基因缺陷的动物，处理天数较多；而基因缺陷动物则可能处理天数较少，即其出现间歇性低氧相关病理表现较早，如ApoE基因敲除小鼠[49]在CIH和高脂饮食联合诱导下可以较早地表现出AS病理变化。此外，根据具体实验的不同，CIH处理天数选择还可能与研究者经验、实验条件限制等因素有关。需要注意的是，文献提示啮齿类动物在低氧干预的初期可能出现一定程度的体重下降[34, 50]，但又有相关的研究[51]表明这种体重变化与缺氧程度不同相关且在后期可以恢复。因此，若进行间歇性低氧相关体重、血脂与血糖代谢等与心血管疾病危险因素关系密切的指标观察，在选择间歇性低氧处理时间时应考虑这一因素。
4.2 日处理时间相关研究通常都采用每日某一时间段连续进行间歇性低氧处理实验动物。大鼠、小鼠的昼夜节律较明显，为昼伏夜动，人的工作时间恰与它们的睡眠时间相吻合，因此通常都选择白昼8:00~18:00中的某一时间段连续间歇性低氧处理8 h[52, 53]；也有少数研究日处理时间可达12 h[54, 55]。
5 缺氧循环模式的选择区别于持续性低氧，间歇性低氧以缺氧-复氧反复循环为特点，模拟这一循环模式是间歇性低氧动物模型建立的关键步骤。缺氧循环模式包括每一缺氧-复氧循环时长、由常氧降至最低氧浓度所用时间、维持最低氧浓度时间、复氧所用时间等，这是不同间歇性低氧动物模型研究的最大差异所在，几乎每一个研究都有不同的缺氧循环模式。根据缺氧达到最低氧浓度后是否维持一段时间可分为氧浓度渐变模式和最低氧浓度维持模式两类：
5.1 氧浓度渐变模式指在一定时间内将氧浓度降到实验要求的最低氧浓度，然后立即复氧(如Fig 1A)，这种模式中由常氧降至最低氧浓度所用时间与复氧所用时间通常相等。最常见的是1 min间歇性低氧循环周期中，前30 s降至最低氧浓度，后30 s逐渐复氧[35, 56]；也有如Alba Carreras等的研究[12]将缺氧和复氧时间分别设置为90 s。
5.2 最低氧浓度维持模式指在一定时间内将氧浓度降到实验要求的最低氧浓度，维持最低氧浓度一段时间，然后复氧(如Fig 1B)，这种低氧持续一段时间的模式能更类似于人的睡眠呼吸暂停。采用这种模式的研究之间每一缺氧循环周期长度不等，周期中缺氧持续的时间也不等[31, 39, 57]。有研究者[16]观察间歇性低氧对SD大鼠血压的影响，选择的缺氧循环模式以6 min为一个周期，在1 min内达到最低氧浓度10%，保持最低氧浓度2 min，后3 min转为常氧。另有研究[39]观察间歇性低氧相关AS，选择1 min为一个缺氧循环周期处理C57BL/6J小鼠，在前30 s内降到最低氧浓度6.0%~6.5%并保持5~7 s，后30 s复氧；一项观察OSAHS大鼠脂肪因子vaspin与胰岛素信号通路关系的研究中也采用的这种缺氧循环方式[58]。有学者[59]在研究间歇性低氧过程中炎症反应的发生时，以SD大鼠为实验对象，以120s为缺氧循环周期，将氮气快速充入低氧舱使氧浓度降到最低氧浓度8%，维持30 s，然后快速充入纯氧使氧浓度上升达常氧，维持30 s，结果发现间歇性低氧促进炎症因子白介素-1(IL-1)的释放。
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| Fig 1 Two different types of hypoxia circulation mode A: FIO2 gradient mode; B: Nadir FIO2 maintaining mode;FIO2: Fraction of inspiration O2, t: Time |
国内有研究者对不同缺氧循环模式的间歇性低氧动物模型进行比较，将各组SD大鼠的缺氧循环中低氧时间、常氧时间、最低氧浓度分别设置为，45 s、45 s、10%，30 s、30 s、10%，30 s、30 s、5%，通过测量动脉氧分压(PO2)及氧饱和度(SaO2)发现，以上3组PO2及SaO2均低于常氧对照组(P＜0.05)，且3组间比较PO2及SaO2依次降低(P＜0.05)，成功通过这3种模式分别模拟轻、中、重度OSAHS[60]。目前尚无研究同期比较氧浓度渐变模式与最低氧浓度维持模式对间歇性低氧动物模型的影响有何明确差异，没有证据证明何种模式成模率更高或模型更稳定，有待于进一步研究完善。
6 小结与展望OSAHS相关动物模型有多种类型，如自发动物模型、手术动物模型及非手术动物模型等[61]。CIH在OSAHS导致心血管病的发生过程中扮演了非常重要的角色，目前研究都倾向于非手术方法，控制环境空气的氧浓度形成缺氧-复氧循环，以模拟CIH过程，这种方法简单易操作，便于相关研究广泛应用。目前造模方法主要的不同之处在于缺氧循环模式，其次为缺氧处理天数、动物种类的选择。总的来说，间歇性低氧动物模型主要选用成年♂啮齿类动物(大鼠、小鼠)，选用能够自动控制气体输入、转换的仪器设备，配套使用密闭性良好的动物培养箱、氧浓度检测设备，通过输入氮气、氧气、空气等不同气体改变培养箱内的氧浓度，使其在5%~10%至空气氧浓度间规律循环变化，每日处理8~12 h，连续处理约4~12周，可能能够观察到血压升高、炎症反应、血管内皮损伤、胰岛素敏感性降低、动脉斑块形成等心血管病理变化，从而用于CIH相关心血管疾病的研究。需要注意的是，目前研究表明，在高脂饮食条件下，CIH可加速AS的形成，但其是否能够独立介导AS的形成仍有待研究。
自1992年Fletcher等[62]首次报道通过CIH大鼠模型研究CIH与高血压关系以来，CIH相关心血管疾病的动物研究已有20余年，目前仍属于研究的热点之一。无论是CIH动物模型本身还是相应的治疗方法都处于探索阶段，尚有较大的研究空间。目前文献报道的各种CIH造模方法在氧浓度、缺氧气体选择、处理周期等许多细节方面存在较多差异，新的研究多根据文献或既往经验设计造模方案，仍期待出现更可靠的研究为间歇性低氧动物模型的规范化提供实证依据。
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