2.扬州市第一人民医院,江苏扬州225009
2. Yangzhou No.1 People's Hospital,Yangzhou Jiangsu 225009,China
共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是一组具18个碳原子，含有共轭双键的多不饱和脂肪酸，是必需脂肪酸亚油酸的同分异构体。近年来大量动物试验表明，CLA具有抗癌[1]、抗动脉粥样硬化[2]、降低脂肪沉积[3]等重要生理功能。虽然目前国内外关于CLA对癌细胞凋亡的影响已做了大量研究工作，但还未见t9,t11-CLA单体抗癌活性的报道。本文通过比较3种CLA异构体——c9,t11-CLA；t10,c12-CLA；t9,t11-CLA对乳腺癌细胞MCF-7细胞生长、凋亡及细胞周期的影响，以筛选出更有效抗癌的CLA异构体。
1 材料 1.1 试剂人乳腺癌细胞MCF-7：北京市肿瘤研究所；t9,t11-CLA(纯度98%)：Matreya，USA；c9,t11-CLA，t10,c12-CLA(纯度98%)：南昌华兴生物科技有限公司。
DMEM培养液、0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、Hoechst 33258荧光染料：北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清：美国Hyclone公司；DNA含量检测试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司。
1.2 仪器MCO-18AIC(UV) CO2培养箱：(日本)三洋电机株式会社；BD FACS Calibur流式细胞仪：美国PE公司；酶标仪：美国Molecular Devices；倒置荧光显微镜：重庆光学仪器厂。
2 方法 2.1 人乳腺癌MCF-7细胞培养配制含10%胎牛血清、1×105 U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的DMEM全培养基，在 5% CO2和37 ℃条件下培养人乳腺癌MCF-7细胞，每隔24～48 h更换培养基，常规消化传代，取对数生长期细胞进行实验。
2.2 CLA溶液的制备配制浓度为200 mmol·L-1的CLA储备液，保存于-20℃。用前将其用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释，至终浓度分别为25、50、100和200 μmol·L-1。
2.3 MTT法测定MCF-7细胞增殖的抑制活性取对数生长期的MCF-7细胞，接种于96孔板，每孔200 μL(1×104细胞/孔)，培养过夜，按不同浓度(25、50、100、200 μmol·L-1) CLA进行药物干预24 h。加入MTT(5 g·L-1)20 μL每孔，培养箱中保温4 h后，弃孔内培养液，加DMSO 200 μL每孔，置摇床上低速振荡15 min，用酶标仪检测各组细胞在490 nm波长处的OD值[4]。另设阴性对照组和调零孔(不加细胞)。每组设5个复孔，实验重复3次。
细胞抑制率/％=1-[(药物组OD值-调零孔OD值)/(对照孔OD值-调零孔OD值)×100%]
2.4 荧光染色观察MCF-7细胞凋亡MCF-7细胞接种于12孔培养板，每孔600 μL(5.0×104细胞·孔-1)，细胞培养过夜后加入不同浓度(0、50、100、200 μmol·L-1 )的CLA，48 h后，PBS洗涤细胞，加10 mg·L-1 Hoechst 33258荧光染料染色，37℃孵育8 min，PBS洗涤两次，超净工作台中避光风干后进行观察。
2.5 FCM检测MCF-7细胞凋亡和细胞周期取对数生长期MCF-7细胞，接种于6孔培养板(每孔3×105细胞)，培养过夜后分别加入终浓度为50、100 μmol·L-1的CLA，48 h后，PBS洗涤细胞，将细胞制成单细胞悬液，收集细胞。参照DNA含量检测试剂盒说明书处理细胞，用流式细胞仪对样品进行凋亡和周期分析。每组设3个复孔，实验重复3次。
2.6 统计学处理使用SPSS统计软件，采用One-way ANOVE法对数据进行差异显著性分析(P < 0.05)。
3 结果 3.1 CLA对MCF-7细胞增殖的抑制率3种CLA单体随着作用浓度的增加，抑制作用均增强。在≤50 μmol·L-1的浓度时，t10,c12-CLA对细胞的抑制作用强于c9,t11-CLA；在≥100 μmol·L-1时，c9,t11-CLA对细胞的抑制作用强于t10,c12-CLA。t9,t11-CLA在不同浓度下的增殖抑制率均高于其他2种CLA单体(P< 0.05)。
3.2 荧光显微镜下观察MCF-7细胞凋亡对照组的细胞核呈弥漫性均匀荧光，荧光较弱，实验组随CLA浓度增加可见明显的凋亡细胞核：细胞核体积变小，皱缩，呈致密浓染的颗粒块状荧光。t9,t11-CLA组在50 μmol·L-1的浓度时就表现出明显的促进MCF-7细胞凋亡的作用。
3.3 用流式细胞仪测定凋亡率及细胞周期3种CLA异构体在50和100 μmol·L-1浓度下对MCF-7细胞均产生较强的促凋亡作用。其中t9,t11-CLA对MCF-7细胞的凋亡率分别为28.34%和34.66%，与对照组相比，分别增加了24.93%和31.25%，细胞凋亡率呈明显提高(P < 0.05)。
随CLA浓度增加，MCF-7细胞G0/G1期缩短，S期延长，由此可见，CLA可将细胞阻滞在S期。50和100 μmol·L-1的t9,t11-CLA组的G0/G1期细胞比率分别下降至53.17%和42.72%，S期延长的幅度分别为26.96%和32.63%，呈明显增加(P < 0.05)。
4 讨论CLA是食物中的天然成分，对人体无毒副作用。本研究中，应用人乳腺癌MCF-7细胞为体外模型，用MTT法、荧光染色及流式细胞术对c9,t11-CLA，t10,c12-CLA和t9,t11-CLA 3种单体的抗乳腺癌活性及促进癌细胞凋亡能力进行了研究。结果发现，3种CLA异构体均可抑制MCF-7细胞增殖并促进细胞凋亡，t9,t11-CLA在抑制MCF-7细胞增殖、促进细胞凋亡方面是最有效的CLA单体。细胞周期分析结果表明，随CLA浓度增加，MCF-7细胞G0/G1期缩短，S期延长，表明CLA可将细胞阻滞在S期，对细胞增殖有明显的抑制作用。因此，CLA的抗癌作用可能是通过影响细胞周期进程，进而抑制细胞分裂增殖和诱导凋亡。本研究为今后乳腺癌的预防与治疗研究提供了实验依据。
(致谢：本实验在中德联合研究院和食品科学与技术国家重点实验室完成，衷心感谢刘晓华老师、刘萍老师、李响敏老师、李海星老师对我实验的指导与帮助，感谢李加肖师妹对我实验的帮助！)
| [1] | Rakib M A, Lee W S, Kim G S, et al. Antiproliferative action of conjugated linoleic acid on human MCF-7 breast cancer cells mediated by enhancement of gap junctional intercellular communication through inactivation of NF-κB[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013, 11(33): 1-12. |
| [2] | Eftekhari M, Aliasghari F, Beigi M A, et al. The effect of conjugated linoleic acids and omega-3 fatty acids supplementation on lipid profile in atherosclerosis[J]. Adv Biomed Res, 2014, 3(1): 15-9. |
| [3] | Carvalho R F, Uehara S K, Rosa G. Microencapsulated conjugated linoleic acid associated with hypocaloric diet reduces body fat in sedentary women with metabolic syndrome[J]. Vasc Health Risk Manag, 2012, 8: 661-7. |
| [4] | 木合布力·阿布力孜,王永波,徐方野,阿布力孜·阿布杜拉.异甘草素和3-甲氧基异甘草素对人肝癌Bel-7402细胞的抗癌活性[J].中国药理学通报,2014,30(6):887-8. Mourboul A,Wang Y B,Xu F Y,Abulizi A. Anticancer property of isoliquiritigenin and 3-oximethyl-isoliquiritigenin in human Bel-7402 hepatoma cell lines[J]. Chin Pharmacol Bull,2014,30(6):887-8. |