由梓醇和葛根素配伍制成的抗缺血性中风新药——梓葛冻干粉针(injection of lyophilized powder with catalpol and puerarin,C-P)，可透过血脑屏障并且是安全的[1, 2]，可明显减少中风模型小鼠大脑梗死灶面积[3]。本研究在体外构建神经血管单元(neurovascular unit,NVU)模型并作氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)损伤[4]，观察C-P对NVU的整体保护作用，探讨其抗炎和抗氧化机制，为C-P治疗缺血性中风提供科学依据，也为缺血性中风的治疗药物筛选提供一种多细胞体外研究模式。
1 材料与方法 1.1 动物SPF级♀、♂ SD大鼠购自重庆市中药研究院，合笼饲养于西南大学药学院实验动物中心。
1.2 药物和试剂梓醇和葛根素(批号均为20111003)购自石家庄流波白鸟生物科技有限公司，纯度均≥98%；C-P由本实验室研制，批号20120613；胎牛血清、DMEM-F12 培养基和B27均购自Gibco；胰蛋白酶、明胶、BSA和L-多聚赖氨酸均购自Sigma；所有抗体均购自中国中杉金桥生物技术有限公司；所有试剂盒均购自中国上海源叶生物技术有限公司。
1.3 原代细胞培养大鼠大脑皮质微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元的培养分别参考文献方法[5, 6]。
1.4 NVU模型构建及其OGD/R损伤参考前期方法[4]，星形胶质细胞接种在插入池外侧，4 h后放入培养了2 d神经元的6孔板内；共培养2 d后，将微血管内皮细胞接种于插入池内侧，再共培养3~5 d即建成NVU模型。OGD/R 损伤参考前期方法[4]并略作改进，将NVU培养基换成无糖培养液放入37℃三气培养箱缺氧4 h后，再换成含糖培养液，正常条件培养2 h。
1.5 模型损伤成功标准及分组给药以跨内皮电阻值(TEER)明显低于正常(P＜0.05)为OGD/R 损伤成功依据。实验共分5组，正常对照组细胞用培养基正常培养，损伤模型随机分为4组：OGD/R组、OGD/R + C-P 3个剂量组(49.00、24.50和12.25 mg·L-1)。OGD/R + C-P组分别在更换无糖培养液和复糖培养液时，两次加入C-P。
1.6 细胞形态观察用显微镜观察不同组别中3种细胞的形态并拍照比较。
1.7 ELISA试剂盒检测蛋白含量及活性取各组培养上清液，参照试剂盒说明书检测NO和MDA含量以及LDH和SOD活性。
1.8 Western blot检测蛋白表达裂解并收集各组细胞裂解液，用SDS-PAGE分离蛋白，检测TNF-α、NF-κB、IL-6和IL-1β含量。
1.9 数据分析数据用SPSS 17.0进行单因素方差分析，统计结果以x±s表示。
2 结果 2.1 C-P明显减轻OGD/R对细胞的形态损伤与正常对照组相比，OGD/R组神经元胞体明显缩小，轴突变细，轴突网络密度降低；微血管内皮细胞和星形胶质细胞胞体收缩并有部分脱落。与OGD/R组相比，C-P 24.50和49.00 mg·L-1组神经元胞体仅有轻微收缩，轴突及其网络无明显变化；微血管内皮细胞和星形胶质细胞胞体轻微收缩，无细胞脱落。
2.2 C-P明显减轻OGD/R对细胞的氧化损伤与正常组相比，OGD/R组MDA和NO含量、LDH活性均明显增加(P＜0.01)，SOD活性明显降低(P＜0.01)。与模型组相比，C-P49.00和24.50 mg·L-1组MDA和NO含量、LDH活性均明显降低(P＜0.05)，SOD活性明显升高(P＜0.05)。
2.3 C-P明显抑制促炎症细胞因子和NF-κB过表达与正常组相比，OGD/R组NF-κB 、IL-6、IL-1β和TNF-α表达均明显增加(P＜0.01)。与OGD/R组相比，C-P 49.00和24.50 mg·L-1组该4个蛋白表达均明显降低(P＜0.05)。
3 讨论缺血性中风不仅损伤大脑神经元，神经胶质细胞和微血管也有损伤并相互影响，其病理机制涉及炎症、氧化应激、能量障碍、兴奋性氨基酸毒性等。因此，对NVU进行整体保护已成为治疗缺血性中风的重要策略[7]。本研究显示，由梓醇和葛根素配伍制成的C-P可明显改善OGD/R损伤中NVU细胞的生长形态，具有明显抗炎和抗氧化损伤作用。该研究有助于阐明C-P的多靶点和多细胞保护机制。
(致谢：感谢西南大学药学院分子药理实验室各位老师和同学的支持与帮助！)
| [1] | Qin W, Mao X, Chen W, et al. HPLC-APCI-MS/MS method for the determination of catalpol in rat plasma and cerebrospinal fluid: Application to an in vivo pharmacokinetic study[J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 70(21):337-43. |
| [2] | 原欢欢,张继芬,王琴,等. 梓葛冻干粉针的局部刺激性、过敏性、溶血性和急性毒性研究[J]. 中国药理学通报,2013,29(6):880-1. Yuan H H, Zhang J F, Wang Q, et al. Focal irritant, allergia, haemolyticus and acute toxicity of Catalpol and Puerarin for injection[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29(6):880-1. |
| [3] | Liu Y, Xue Q, Li X, et al. Amelioration of stroke-induced neurological deficiency by lyophilized powder of catapol and puerarin[J]. Int J Biol Sci, 2014, 10(4):448-56. |
| [4] | Xue Q, Liu Y, Qi H, et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat [J]. Int J Biol Sci, 2013,9(2): 174-89. |
| [5] | Liu Y, Xue Q, Tang Q, et al. A simple method for isolating and culturing the rat brain microvascular endothelial cells [J]. Microvasc Res, 2013, 90(6):199-205. |
| [6] | Nakagawa S, Deli M A, Kawaguchi H, et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes[J]. Neurochem Int, 2009, 54(3-4):253-63. |
| [7] | Lo E H, Dalkara T, Moskowitz M A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke[J]. Nat Rev Neurosci, 2003, 4(5): 399-415. |