2. 哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科, 黑龙江哈尔滨 150001
2. Dept of Neurology, the First Affliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150001, China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),是老年期痴呆最常见的类型,神经细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ) 异常沉积引发的老年斑( SPs) 和神经细胞内Tau 蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(NFTs)是其特征性病理学变化[1]。尽管Aβ和Tau蛋白的关系尚未完全明确,但越来越多的证据表明,不论在体内还是在体外实验,Aβ均可引起的Tau蛋白过度磷酸化,引起神经元微管崩解、轴浆运输障碍,最终导致神经元凋亡,因此Aβ引起的Tau蛋白过度磷酸化被普遍认为是AD的重要的发病机制之一[2]。Aβ可以激活各种蛋白激酶引起Tau蛋白磷酸化,CDK5是最重要的Tau蛋白激酶之一。p35是CDK5神经专一性的激活亚基,在钙依赖性calpain剪切作用下,转变为p25,使CDK5过度激活,从而导致Tau蛋白过度磷酸化[3]。
复方中药复智散(FZS)是用于治疗老年性痴呆多年,临床及实验室研究证明,FZS治疗AD有效;FZS可改善老龄鼠的水迷宫试验,增加痴呆模型鼠脑内乙酰胆碱含量[4];FZS对抗Aβ毒性,提高体外神经细胞细胞存活率[5];FZS治疗AD患者可改善认知功能,提高生活能力,PET证实增加患者脑内糖代谢[6, 7]。但FZS对Tau蛋白磷酸化的作用尚不清楚。本研究运用凝聚态Aβ25-35建立皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化的细胞模型,探讨FZS能否通过calpain-CDK5通路抑制Tau蛋白过度磷酸化,为FZS治疗AD提供更新的理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物新生24 h内Wistar大鼠(清洁级),由山东大学动物中心提供。
1.2 试剂FZS中药合剂由哈尔滨医科大学第一临床医学院神经科王德生教授组方,由人参、当归、黄芩、节菖蒲按比例(2:1:1:1)组成,原料购自哈尔滨市药材公司,加工为粉剂后文火煎制30 min,3 000 r·min-1离心10 min,吸取上清,留取上清过滤配成浓度为0.5 g·mL-1的贮存液,0.15 kPa压力灭菌30 min,分装,4℃保存2周或-20℃冻存。实验中给药剂量以水提液中所含生药的量计算。胎牛血清购自杭州江滨生物技术有限公司。Neurobasal培养基购Invitrogene公司。Aβ25-35 淀粉样肽片段购Sigma公司,多克隆抗体Tau(Ser396)、Tau(Ser202)、Tau(Thr231)、p35/25(C-19)、CDK5 (C-8)购置Santa Cruz公司。Western blot化学发光检测试剂盒购自KPL公司。
1.3 皮层神经元原代培养在无菌条件下取出胎鼠,解剖分离大脑皮层,分散细胞,将神经细胞以5×104每孔的密度接种于涂有左旋多聚赖氨酸的96孔板中,以2×105每孔的密度种植于24孔板中(孔板中放置12 mm的载玻片),细胞接种后,将孔板置于5%的CO2、37℃、饱和湿度培养箱中过夜,24 h后更换培养基,将种植液(Neurobasal培养基约88.5%,胎牛血清10%,谷氨酰胺储备液1%,青链霉素储备液 0.5%)更换为饲养液(Neurobasal培养基约95.5%,N-21%,B-27 2%,谷氨酰胺储备液1%,青链霉素储备液 0.5%)。以后每48 h半量换液一次。皮层神经元在体外培养7 d后,应用FZS(20 mg·L-1)、Roscovitine (15 μmol·L-1)或Calpeptin(20 μmol·L-1)预处理24 h,然后用20 μmol·L-1 Aβ作用24 h。
1.4 Western blot分析将种植于24孔的神经元进行各种干预后,吸尽培养基,PBS冲洗,冷胰酶裂解20 min,用细胞刮刀将细胞刮下,离心(2 000 r· min-1 5 min),吸上清液至EP管中,Bradford法进行蛋白定量。以10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,用半干电转移法将蛋白转移到硝酸纤维素膜,室温下用封闭液封闭1 h后,将膜移入用封闭液稀释的一抗Tau[pSer396],Tau[pSer202],Tau[pThr231],p35多克隆抗体和Tau-5单克隆抗体(1:10 000稀释),4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:1 000稀释)反应2 h,用化学发光法显色,X线底片曝光,β-actin作为内参照,凝胶图像分析仪(Alpha Imager 2200,美国安莱公司)计算点密度。实验重复3次。
1.5 CDK5激酶活性测定体外培养的皮层神经元经各种干预后,吸尽培养基,裂解蛋白,取蛋白200 μg,用CDK5抗体10 μg,加入细胞溶解缓冲液中(50 mmol·L-1 Tris-HCl,pH 7.4,80 mmol·L-1 b-glycerophosphate,20 mmol·L-1 EGTA,15 mmol·L-1 MgCl2,and 1 mmol·L-1 dithiothreitol),在4℃环境下孵育1 h。所产生的免疫复合物用Asepharsose沉降法收集,收集到的免疫复合物用清洗缓冲液清洗,然后,将该免疫复合物用CDK5激酶缓冲液包括50 μmol·L-1 ATP,1.25 μCi-γ32 ATP,和500 μmol·L-1 histone H1作为底物在室温下孵育20 min,最后用液体闪光计数器测定。
1.6 calpain活性测定取蛋白20 μg放入96孔板中,每孔加入130 μmol·L-1 calpain底物N-succiny lleu-tyr-7-amido-4-methylcoumarin,在室温下孵育30 min。N-succinyl-leu-tyr-7-amido-4-methylcoum-arin (calpain底物)本身是非荧光性的,其被calpain(Calpain)裂解后能发出荧光。应用酶标仪(550 Bio-Rad)检测荧光,激发波长为360 nm,发射波长为480 nm,检测数值间接反映calpain的活性。
1.7 统计学处理实验结果以x±s表示,SPSS13.0软件包行单因素方差分析,方差齐者组间比较用LSD检验,方差不齐者用Games-Howeu检验。
2 结果 2.1 FZS抑制Aβ25-35导致的皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化为探讨FZS对皮层神经元Tau蛋白磷酸化作用,应用能够分别识别Ser396、Ser202、Thr231这3个位点的磷酸化抗体,Western blot检测磷酸化Tau蛋白的表达情况。如Fig1显示,20 μmol·L-1 Aβ25-35作用于皮层神经元24 h,3个不同位点(Ser396、Ser202、Thr231)的Tau磷酸化均明显增加。然而,应用20 mg·L-1 FZS预处理皮层神经元24 h明显缓解Aβ25-35导致的Tau磷酸化作用。CDK5抑制(roscovitine)和calpain抑制剂(calpetin)也有类似的作用,缓解了Aβ25-35导致的Tau磷酸化。
2.2 FZS抑制Aβ25-35导致的CDK5激酶过度激活为了探讨Aβ25-35和FZS对CDK5激酶活性的作用,治疗组皮层神经元应用20 mg·L-1FZS预处理24 h后,再应用20 μmol·L-1 Aβ25-35作用24 h。CDK5激酶活性采用CDK5抗体、免疫沉淀法,应用液体闪烁计数仪检测。和未处理组皮层神经元比较,20 μmol·L-1 Aβ25-35处理组神经元CDK5激酶活性升高了近3倍;20 mg·L-1 FZS治疗则明显抑制了Aβ25-35导致的CDK5激酶活性升高(P<0.01),见Fig2。由此可见,FZS抑制了Aβ25-35导致的CDK5激酶过度激活,但对CDK5激酶本身的生理活性没有影响。
2.3 FZS抑制Aβ25-35导致的p35向p25转变p35是CDK5生理性的激活亚基,在calpain作用下,p35降解、转变为p25能使CDK5过度激活,从而导致神经元变性、凋亡[3]。以往研究发现Aβ暴露能够使皮层神经元的p35转变为p25[8]。本研究为探讨FZS及Aβ25-35对皮层神经元p35或p25是否有影响,应用Western blot,p35/p25抗体检测p35、p25蛋白表达情况。20 μmol·L-1 Aβ25-35处理皮层神经元24 h后,p35蛋白水平明显降低,而p25蛋白水平明显增高;20 mg·L-1 FZS 则抑制Aβ25-35导致的p35向p25转变,见Fig3。结合上述结果,可以推断FZS对CDK5激酶活性的抑制可能是通过抑制Aβ25-35导致的p35向p25转变而实现的。
2.4 FZS抑制Aβ25-35导致的calpain激活p35降解、转变为p25是由calpain激活介导的。因此,我们进一步探讨了FZS和Aβ25-35对calpain活性的作用。经过7 d成熟期的神经元经药物干预后,裂解、提取细胞蛋白,calpain活性的活性应用酶标仪检测。皮层神经元经20 μmol·L-1 Aβ25-35处理24 h后,calpain活性明显增高(P < 0.01),20 mg·L-1 FZS预处理皮层神经元24 h则明显抑制Aβ25-35导致的calpain激活,见Fig4。
3 讨论NFTs是AD的特征性病理改变之一,而NFTs的主要成分是过度磷酸化的微管相关tau蛋白。Tau蛋白磷酸化,可以引起微管崩解,轴浆运输障碍,最终导致神经元死亡[2]。在APP(淀粉样前体蛋白)转基因鼠的实验中发现[9],抑制内源性Tau蛋白可以缓解Aβ引起的认知功能损害,因此,有学者认为,Aβ的神经毒性是通过Tau蛋白磷酸化来实现的,Aβ引起的Tau蛋白磷酸化可能是AD的重要发病机制之一。
越来越大的研究证明,Aβ可以在多个AD发病相关的磷酸化位点导致Tau蛋白磷酸化。Tau蛋白的磷酸化位点很多,研究表明[10] Ser396、Ser202、Thr231这3个位点磷酸化可导致NFTs,中枢神经系统变性,被认为和AD的发病相关。和以往研究相似,20 μmol·L-1 Aβ25-35作用于皮层神经元24 h,明显增加了这3个位点(Ser396、Ser202、Thr231)的Tau蛋白磷酸化。
CDK5是最重要的Tau蛋白激酶之一,其活性受神经专一性的激活亚基p35调节。生理状态下,CDK5在p35调节亚基的信号作用下锚定于膜上,在神经元发育、迁移、神经元存活中发挥重要作用[2, 8]。Aβ暴露或各种应激损害,可导致神经元细胞内钙超载,从而激活calpain。calpain使p35裂解为p25片段,p25十分稳定,不容易降解,为CDK5更稳定的激活亚基,与CDK5结合导致CDK5持久过度激活[11]。过度激活的CDK5导致Tau蛋白过度磷酸化,从而引起微管崩解,损害轴浆运输,导致神经元凋亡。AD患者脑内p25表达水平明显增加,CDK5活性明显升高[12]。在体外培养的神经元中[13],抑制CDK5或calpain活性均明显缓解Aβ导致的Tau蛋白磷酸化及神经元的凋亡,这与本研究结果是一致的,CDK5抑制剂Roscovitine (15 μmol·L-1)和calpain制剂Calpeptin(20 μmol·L-1)均明显抑制了Aβ25-35导致的Tau蛋白磷酸化。在动物试验中也发现CDK5抑制剂缓解了Aβ导致的Tau蛋白磷酸化,提高了AD模型鼠的认知功能。p25转基因鼠的大脑皮层中CDK5活性明显升高,并出现Tau蛋白过度磷酸化,神经原纤维缠结形成,神经元的变性与凋亡,且伴随明显认知功能障碍[14]。
研究认为[11],p25/CDK5导致了Tau蛋白过度磷酸化,因此抑制p35/CDK5向p25/CDK5转变对缓解Tau蛋白过度磷酸化及AD的治疗有重要意义。本研究显示,FZS能够有效抑制Aβ25-35导致的calpain激活,从而缓解了p35向p25转变,降低了CDK5激酶活性,从而减轻了Aβ25-35导致的皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化。calpain是钙依赖性的蛋白激酶,细胞内钙超载是导致其活性过度增高的主要原因。在以往研究中[5],应用PC12细胞体外培养,发现FZS能够对抗Aβ1-42导致的细胞内钙超载,从而起到神经保护作用。由此可见,抑制细胞内钙超载、钙依赖性calpain过度激活,从而抑制p35向p25转变,缓解CDK5过度激活引起的Tau蛋白磷酸化,可能为FZS治疗AD的有效机制之一。
FZS由人参、当归、黄芩等中药组成,其神经保护作用的有效成分尚不完全清楚。人参是我国传统药物,具有增强记忆、益智延年、强身健体之功效。人参的主要有效成份是人参皂苷,包括Rb1、Rg1、Rg2等。人参皂苷Rgl还可通过抗氧化应激、抗神经元凋亡、抑制兴奋性氨基酸毒性、减少钙内流等发挥其对神经元的保护作用[15]。近期,黄天文等[15]应用原代皮层神经元培养,发现人参皂苷Rbl能够抑制CDK5激酶活性,从而抑制Aβ白导致的Tau蛋白过度磷酸化,保护皮层神经元。由此可见,人参皂苷可能为FZS神经保护作用的有效成分之一。其它成分如当归、黄芩是否也具有相似的神经保护作用尚不清楚,在以后的研究中还需进一步探讨。
(致谢:本文实验是在山东省千佛山中心实验室完成,特别感谢曹莉莉主任给予的实验技术指导和帮助。)
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