2. 华北理工大学基础医学院, 河北唐山 063000
奥·乌力吉(1961-), 男, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向: 蒙医内治法研究与蒙药新药研发, Tel: 0475-8314240, E-mail: wuliji@126.com
2. School of Basic Medical Sciences, North China Universitiy of Science and Technology for Hebei, Tangshan Hebei 063000, China
胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是多种代谢疾病的病理基础,是引起2型糖尿病的关键机制,也是 2 型糖尿病的主要特征及病情进展的关键因素[1, 2]。因此,改善IR药物的研究备受人们关注。GK大鼠(Goto-Kakizaki Rat) 是国际公认的研究2型糖尿病较为理想的自发性非肥胖型动物模型[3],主要表现胰岛功能受损及胰岛素抵抗,与人类 2 型糖尿病发病因素及病程特点尤为相似,在新药研究与开发中具有重要价值[4]。沙蓬为藜科植物沙蓬Agriophyllum squarrosum (L.)Moq.的干燥地上部分,是中国蒙医常用传统药材,具有祛疫、清热、解毒、利尿功能,亦用于治疗消渴病[5, 6, 7]。目前尚未见有关沙蓬提取的粗寡糖(AOS)对胰岛素抵抗影响的研究报道。本实验应用AOS干预自发 2 型糖尿病GK大鼠,观察其对胰岛素抵抗的影响,为沙蓬的进一步开发应用提供研究基础。
1 材料 1.1 实验动物♂ SPF级自发性2型糖尿病GK大鼠,体质量210~240 g,10~13周龄;购自上海斯莱克斯实验动物责任有限公司,许可证号:SCXK(沪)2012-0002;♂ SPF级Wistar大鼠,体质量230~240 g,12~13周;购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号: SCXK(京)2014-0002;大鼠饲料购自中国解放军军事医学科学院,许可证号:SCXK(军)2014-0001;高脂饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,合格证号:SCXK(京)2009-0008;均于华北理工大学动物实验中心SPF级屏障实验室,以每笼5只进行饲养。
1.2 受试药物沙蓬粗寡糖(AOS)由内蒙古蒙医药工程技术研究院提供。为沙蓬稀醇提取,大孔树脂纯化,脱色得粗寡糖。
1.3 主要药品、试剂格列苯脲(glibenclamide)(天津太平洋制药有限公司,批号:1301120),葡萄糖氧化酶试剂盒(长春汇力生物技术有限公司,批号:20140505),CHO、TG、HDL-C、LDL-C试剂盒(北京瑞正善达生物工程技术有限公司,批号:20140330),胰岛素试剂盒(美国拜力生物科技有限公司,批号:20150505)。
1.4 实验仪器电子天平(型号FA2104N,上海菁海仪器有限公司),高速低温离心机(型号5180R,德国Eppendorf公司),实验室超纯水制备系统(型号RODI-P,上海和泰仪器有限公司),生物安全柜(型号BSC-1300IIA2,上海博讯实业有限公司),γ放射免疫计数器(型号GC-1200,安徽中科中佳科学仪器有限公司),罗氏血糖仪及试纸(德国罗氏诊断有限公司),生物组织自动石蜡包埋机(型号TB718,湖北泰维科技实业有限公司),轮转式切片机(型号RM2245,德国Leica公司),电热恒温鼓风干燥机(型号DGG-9140A,上海森信实验仪器有限公司),高倍显微镜(型号OLYMPUS BX5,日本奥林巴斯有限公司),真彩病理图像分析系统(型号HMIAS-2000,高腾科技有限公司)。
2 方法 2.1 给药剂量与给药途径设计受试药物沙蓬原药材临床用法与用量为65 g·d-1,相当于1.083 g·kg-1生药(成人体质量按60 kg计算)。每克沙蓬粗寡糖(AOS)相当14.4 g生药,成人AOS用量为0.075 g·kg-1。大鼠与人的等效剂量比为6.3 ∶1,故大鼠治疗的等效剂量为0.475 g·kg-1(0.48),相当6.83 g·kg-1生药。大鼠实验时采用3个剂量,分别相当于人临床用量的2倍、1倍(等倍)及0.5倍。给药量分别为AOS 0.96、0.48、0.24 g·kg-1。给药途径为口服(灌胃),容量为5 ml·kg-1,每天一次,均为上午8~10点给药。格列苯脲给药剂量为1.2 mg·kg-1(为人用量6.3倍,相当于人等效量),给药容积为5 ml·kg-1。
2.2 2型糖尿病模型的确定标准大鼠随机血糖及糖负荷2 h血糖均高于11.1 mmol·L-1,即认为已形成2型糖尿病。由于GK大鼠空腹血糖升高不明显(在4~8 mmol·L-1),随机血糖有1/2在11.1 mmol·L-1,糖负荷2 h有3/4血糖在11.1 mmol·L-1 以上,因此随机血糖在11.1 mmol·L-1 以下大鼠给予高脂饲料诱导4~5周。65只GK大鼠经5周的高脂饲料诱导,有53只(81.5%)大鼠随机血糖及糖耐量2 h血糖均高于11.1 mmol·L-1,即符合2型糖尿病模型。
2.3 分组与给药将符合成模标准的53只大鼠,剔除体重较低或较高及血糖过高的3只大鼠,余下50只,按随机数字表法分为5组,加上正常对照组共6组,每组10只。分别为:模型对照组(MC)、格列苯脲组(GLB)、AOS高(AOS-H)、中(AOS-M)、低剂量组(AOS-L)、正常对照组(NC)。分组后,按设计灌胃给予相应药物,模型对照组与正常对照组每天灌胃同容积蒸馏水。各组均在上午8~10点灌胃给药,每天1次,连续8周。
2.4 观察指标 2.4.1 空腹和随机血糖分别于给药前、后用罗氏血糖仪测定禁食16 h空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和非禁食的随机血糖(random blood glucose,RBG)(上午8:00给药后30 min)。
2.4.2 非葡萄糖负荷的血糖、胰岛素变化及糖耐量(OGTT)给药7周进行非禁食情况下(上午8:00点)灌胃给药,分别于给药前(0 min)及给药后30、60和120 min用毛细管取眼眶静脉丛血,用血糖仪测定血糖,同时分离血清用放免法测定0、60、120 min的血清胰岛素含量,目的是观察药物对胰岛素释放的影响及与血糖关系;OGTT:给药8周(处死之前)用血糖仪测定葡萄糖耐量:即前一天晚上断食不断水,更换垫料,断食16 h后,用血糖仪检测0 min血糖值,灌胃葡萄糖(2.5 g·kg-1)后30、60、120 min血糖值,根据血糖值和梯形面积求和法计算曲线下面积(AUC),其中 G0、G30、G60、G180为各点血糖值。AUC=15(G0+G30)+15(G30+G60)+30(G60+G120)。
2.4.3 血清空腹血糖(FPG)、胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)给药8周后禁食12 h,大鼠用10% 水合氯醛以3 ml·kg-1腹腔注射麻醉,经腹主动脉取血并分离血清,用葡萄糖氧化酶法测定FPG(fasting plasma glucose,FPG),放射免疫法测定FINS含量并计算HOMA-IR,HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。
2.4.4 大鼠胰腺组织HE染色病理观察大鼠取血后,立即剖腹取胰腺,固定于4%多聚甲醛中(72 h以上)。将胰腺从固定液中取出,作常规石蜡包埋,HE染色。将染色的组织切片置于OLYMPUS BX50高倍显微镜下观察并用病理图像分析系统记录和拍照组织形态改变。
2.5 统计学分析实验数据以x ± s表示,用SPSS17.0版软件对数据进行分析,组间差异比较采用方差分析。
3 结果 3.1 AOS对GK大鼠FBG和RBG的影响Tab 1显示,给药前后所有GK大鼠FBG和RBG均明显高于正常对照组(P<0.01),给药前、后各GK大鼠间FBG无差异(P>0.05);AOS干预8周后,与模型组比较,AOS各剂量组大鼠RBG明显降低(P<0.01),AOS 3个剂量之间无明显量效关系(P>0.05),以中剂量效果更好,与格列本脲相近。
Group | Dose/mg·kg-1 | FBG | RBG | ||
0 wk | 8 wk | 0 wk | 8 wk | ||
∆∆P<0.01 vs normal group; **P<0.01 vs model group | |||||
CN | - | 4.33±0.54 | 4.62±0.53 | 5.25±0.49 | 5.60±0.54 |
MC | - | 5.66±0.58∆∆ | 5.64±0.29∆∆ | 13.45±1.57∆∆ | 17.49±2.88∆∆ |
GLB | 1.2 | 5.61±0.97∆∆ | 5.84±0.97∆∆ | 13.57±1.52∆∆ | ]9.07±1.07**∆∆ |
AOS-H | 960 | 5.68±1.13∆∆ | 5.71±0.43∆∆ | 13.65±2.48∆∆ | 11.58±3.02**∆∆ |
AOS-M | 480 | 5.89±0.91∆∆ | 5.63±0.50∆∆ | 13.97±2.70∆∆ | 11.10±3.85**∆∆ |
AOS-L | 240 | 5.63±1.51∆∆ | 5.67±0.64∆∆ | 13.87±2.55∆∆ | 12.39±1.97**∆∆ |
Tab 2~3和Fig 1~2为非禁食非糖负荷情况下观察(上午8点)灌胃给药前(0 min)、后(30、60、120 min)血糖和血清胰岛素变化情况,目的是观察AOS对胰岛素释放的影响及与血糖的关系。结果显示。正常对照大鼠血糖略有升高,而GK模型组大鼠血糖明显升高,可能是由于眼眶取血对大鼠应激性刺激使血糖升高;格列本脲及AOS各剂量组大鼠血糖并未升高;反而有不同程度降低。与灌胃给药前比较,灌胃给药30 min AOS各组血糖就开始降低,血糖降低百分率明显高于格列本脲;给药60 min血糖降低百分率以AOS中剂量最明显(15.94%),其次是格列本脲(9.53%);120 min血糖降低百分率AOS中剂量组(20.83%)与格列本脲(21.10%)非常相近,其次为AOS高(17.64%)、低(13.94%)剂量,见Fig 1、Tab 2。
Group | 0 min | 30 min(↑ %) | 60 min(↑ %) | 120 min(↑ %) |
∆∆P<0.01 vs normal group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group; “-”indicates reduction | ||||
CN | 5.31±0.55 | 5.54±0.55(4.35±0.39) | 5.77±0.43(8.41±0.47) | 5.66±0.64(6.68±0.57) |
MC | 14.28±2.99∆∆ | 16.08±1.78∆∆(12.61±1.27∆∆) | 17.18±0.94∆∆(20.58±3.23∆∆) | 16.28±3.41∆∆(14.71±2.06∆∆) |
GLB | 11.23±2.28∆∆** | 11.06±2.05∆∆**(-1.52±0.54∆∆**) | 10.19±2.18∆∆**(-9.53±2.35∆∆**) | 8.86±2.09∆∆**(-21.10±3.35∆∆**) |
AOS-H | 12.13±1.95∆∆* | 11.29±1.48∆∆**(-6.76±1.05∆∆**) | 11.17±1.11∆∆**(-7.44±1.08∆∆**) | 9.72±1.4.24∆∆**(-17.64±2.48∆∆**) |
AOS-M | 11.04±2.82∆∆** | 10.17±1.87∆∆**(-7.74±1.28∆∆**) | 9.28±1.10∆∆**(-15.94±2.47∆∆**) | 8.74±0.82∆∆**(-20.83±3.53∆∆**) |
AOS-L | 12.41±2.851∆∆* | 11.38±2.04∆∆**(-9.65±2.10∆∆**) | 11.51±2.27∆∆**(-7.25±1.59∆∆**) | 10.68±1.69∆∆**(-13.94±2.25∆∆**) |
Group | 0 min | 30 min(↑ %) | 60 min(↑ %) | 120 min(↑ %) |
∆P<0.05, ∆∆P<0.01 vs normal group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group; “-”indicates reduction | ||||
CN | 0.99±0.35 | 1.07±0.28(8.01±1.51) | 1.31±0.181(32.36±0.47) | 1.35±0.15(36.3±4.46) |
MC | 0.86±0.35 | 0.85±0.36∆(-1.11±0.33∆∆) | 0.82±0.32∆∆(-4.65±1.26∆∆) | 1.01±0.31∆(17.09±4.37∆∆) |
GLB | 0.65±0.47 | 0.80±0.29∆(23.08±3.83∆∆**) | 0.92±0.36(41.45±6.27∆**) | 1.16±0.34(78.89±12.62∆∆**) |
AOS-H | 0.58±0.19 | 0.61±0.27∆(5.17±1.12∆∆**) | 0.63±0.22∆∆(8.63±2.41∆∆**) | 1.13±0.35(94.82±16.83∆∆**) |
AOS-M | 0.42±0.22∆* | 0.64±0.28∆(52.38±6.26∆∆**) | 0.68±0.31∆∆(61.91±9.41∆∆**) | 1.07±0.26∆∆(154.75±15.74∆∆**) |
AOS-L | 0.32±0.18∆∆* | 0.49±0.23∆∆(53.13±8.46∆∆**) | 0.52±0.23∆∆(62.65±8.35∆∆**) | 0.93±0.32∆(190.63±15.51∆∆**) |
从Tab 3和Fig 2可见,正常大鼠胰岛素水平随着血糖升高而增加,以120 min增加更明显;与0 min比较,模型对照组胰岛素升高百分比在30 min和60 min为0,在120 min有低幅度升高;格列本脲和AOS各剂量组均能升高血清胰岛素水平,并且血清胰岛素含量与血糖水平呈负相关;虽然在不同剂量AOS组各时间点胰岛素含量上均低于格列本脲,但与0 min比较,AOS各点胰岛素含量提高百分率均明显高于格列本脲(P<0.01),以AOS中、低剂量升高更明显。提示AOS可促进胰岛素释放,在释放时间和释放量上均早于和强于格列本脲。
3.3 AOS对GK大鼠OGTT的影响给药8周后OGTT结果显示,与模型组比较,AOS对葡萄糖负荷后的血糖升高均有明显抑制作用,以AOS中剂量血糖降低幅度最大(P<0.01),AUC最小;其次是AOS低、高剂量(P<0.01);AOS降血糖作用好于格列本脲(P<0.05);AOS各剂量间差异不明显,见Tab 4。
Group | 0 min | 30 min | 60 min | 120 min | AUC |
∆∆P<0.01 vs normal group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group | |||||
CN | 4.62±0.53 | 6.59±0.61 | 6.91±0.70 | 5.48±0.74 | 742.35±82.9 |
MC | 5.64±0.29∆∆ | 16.10±1.73∆∆ | 15.84±1.59∆∆ | 15.31±1.5∆∆ | 1827.30±185.36∆∆ |
GLB | 5.84±0.97∆∆ | 14.47±1.33∆∆* | 13.71±1.79∆∆** | 9.11±2.05∆∆** | 1407.96±186.38∆∆** |
AOS-H | 5.71±0.43∆∆ | 12.81±2.14∆∆** | 11.56±2.08∆∆** | 10.19±1.90∆∆** | 1295.77±221.38∆∆** |
AOS-M | 5.63±0.50∆∆ | 11.05±2.74∆∆** | 10.02±2.36∆∆** | 8.12±1.13∆∆** | 1110.45±229.23∆∆** |
AOS-L | 5.67±0.64∆∆ | 12.43±3.00∆∆** | 10.81±1.71∆∆** | 9.30±1.83∆∆** | 1222.95±231.33∆∆** |
给药8周后禁食12 h,各组GK大鼠FPG明显高于正常对照组(P<0.01),与模型组比较,GLB和AOS-M组FPG值明显降低(P<0.05),AOS-H与AOS-L组FPG值也较低,但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);FINS含量以正常对照组最高,明显高于各组GK大鼠(P<0.05,P<0.01),各药物干预组FINS含量与模型组比较无统计学差异;而各药物干预组HOMA-IR均低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中以AOS-M最低,AOS高、中、低剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。见Tab 5。
Group | FPG/mmol·L-1 | FINS/ng·L-1 | HOMA-IR |
∆P<0.05, ∆∆P<0.01 vs normal group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group | |||
CN | 4.91±0.52 | 0.75±0.16 | 0.16±0.04 |
MC | 6.87±0.60∆∆ | 0.59±0.16∆ | 0.18±0.05∆ |
GLB | 6.21±0.49∆∆* | 0.62±0.17∆ | 0.17±0.01* |
AOS-H | 6.29±0.57∆∆ | 0.57±0.15∆∆ | 0.16±0.03* |
AOS-M | 6.16±0.62∆∆* | 0.56±0.11∆∆ | 0.15±0.04** |
AOS-L | 6.28±0.67∆∆ | 0.58±0.17∆ | 0.16±0.03* |
正常大鼠胰岛为圆形、椭圆形细胞团,与周围组织界限清晰,形态规则,胰岛数及胰岛内细胞数较多,胰岛细胞胞质丰富,核圆、较大且居中,未见异常(Fig 3A);GK模型大鼠胰岛与周围组织界限模糊不清,形态不规则,部分胰岛细胞完全萎缩,胞质疏松或空泡化,间质明显增生,胰岛组织出现明显的纤维化(Fig 3B);与模型组相比,格列本脲(Fig 3C)组大鼠胰岛形态有所改善,但也存在胰岛数量减少,形状不规则,胰岛内细胞数和体积较模型组有所增加;AOS高(Fig 3D)、中(Fig 3E)、低剂量(Fig 3F)组大鼠胰岛与周围组织界限较清晰,形态稍不规则,胰岛细胞排列基本整齐,细胞间质少量增生,同时可见散在胰岛细胞团块增殖,特别是在血管周围出现胰岛细胞增殖现象,尤其是AOS中剂量胰岛体积较大,与周围组织分布界线较清晰,胰岛细胞排列较整齐,出现散在胰岛细胞团,胰岛细胞增殖现象更明显。
4 讨论2型糖尿病早期阶段以胰岛素抵抗为主,随着病程延长,胰岛β细胞功能逐渐减退,胰岛素分泌减少,使得2型糖尿病病情进一步恶化。目前对糖类的降血糖作用研究主要集中在多糖成分,而对寡糖的降血糖作用研究尚较少[8]。更未见有关沙蓬粗寡糖(AOS)对胰岛素抵抗影响的研究报道。本实验应用AOS高、中、低剂量干预GK大鼠,考察了AOS的降糖和改善胰岛素抵抗作用,并探讨可能机制。
本实验显示,GK大鼠主要特点为空腹血糖升高不明显,并且随着空腹时间延长,血糖反而逐渐降低;但餐后血糖及非空腹血糖(随机血糖)明显升高,随着大鼠周龄的增加而升高;同时发现胰岛及β细胞数量减少、有明显胰岛素抵抗,非常符合2型糖尿病特点,与文献报道一致[9, 10]。AOS能明显降低GK大鼠随机血糖(P<0.01),增加胰岛素释放,改善胰岛素抵抗,促进胰岛细胞增殖/和抑制胰岛细胞凋亡。
AOS对GK大鼠空腹12 h 血糖有降低作用,而对空腹16 h 血糖无影响,但能明显降低随机血糖及糖负荷后的血糖,说明AOS对糖尿病GK大鼠血糖有稳定作用。AOS各剂量之间无明显量效关系(P>0.05),其中,中剂量使大鼠RBG下降最为明显,与格列本脲的结果相近,说明其效果更好。为探讨AOS降糖作用的机制,考察了在非糖负荷非空腹状态下,应用AOS后血糖变化与胰岛素释放情况,排除了糖负荷刺激胰岛细胞释放胰岛素的可能。结果发现GK模型大鼠血糖明显升高,可能是由于眼眶取血对大鼠应激性刺激使血糖升高,同时GK模型大鼠血清胰岛素在30~60 min低于0 min,到120 min较0 min增加了17%,这符合2型糖尿病特点;灌胃给药60 min,AOS中剂量的血糖降低百分率比格列本脲的大;120 min时AOS中剂量组与格列本脲相近;各剂量AOS均能升高血清胰岛素水平,并且血清胰岛素含量与血糖水平呈负相关;与0 min比较,AOS给药组各点胰岛素含量提高百分率均明显高于格列本脲(P<0.01),以AOS中、低剂量升高更明显。提示AOS可促进胰岛素释放,在时间和剂量上均早于和强于格列本脲。进一步OGTT实验也显示,AOS对糖负荷后的血糖升高也有抑制作用,明显降低AUC,其中AOS中剂量降低AUC最明显。2型糖尿病患者胰岛素分泌特点是,第一时相项分泌消失,第二时相项分泌迟缓(峰值后移)[11, 12]。本研究证明AOS应用后第一时相项即能促进胰岛素分泌,提示其对糖尿病餐食血糖调节可能更好。
令人兴奋的是不管是空腹还是非空腹血清胰岛素,在给AOS前均低于模型组,进一步证明AOS促进胰岛素的释放。同时发现,AOS能降低HOMA-IR,以AOS-M最明显,表明AOS能降低胰岛素抵抗,增加胰岛素敏感性,降糖作用可能还存在其它降糖机制。
胰岛β细胞具有一定的自我复制和再生功能,且不需要特定的祖细胞或干细胞参与分化[13, 14],因此如何长期维持胰岛β细胞的数量和正常功能以及促进β细胞增殖已成为治疗糖尿病的关键因素之一[15, 16]。有研究表明,维持胰岛细胞功能最直接有效的方法就是利用药物或其他因子在胰腺内刺激胰岛β细胞增殖或诱导其他细胞向胰岛β细胞转化[17]。本研究通过显微镜观察胰岛组织病理形态结构发现,AOS可使糖尿病GK大鼠胰岛组织病变有不同程度改善,使胰岛体积增大,增加胰岛及胰岛细胞数量,特别是在血管周围出现散在胰岛细胞团块,认为AOS可促进胰岛细胞增殖。可能是AOS中的成分刺激胰岛β细胞增殖或诱导其他细胞向胰岛β细胞转化或抑制胰岛β细胞凋亡,值得深入研究。
综上所述,AOS对自发性2型糖尿病GK大鼠有明显降低随机血糖、改善糖耐量、降低胰岛素抵抗,其中中剂量的结果与格列本脲相近,或是优于格列本脲,说明AOS中剂量效果最好。同时中剂量组比高剂量组的剂量小一倍,从经济方面考虑,其亦为最佳剂量。AOS作用机制可能是快速促进胰岛素释放,促进胰岛细胞增殖,但确切机制有待进一步研究。
(致谢:本研究及论文实验内容是在华北理工大学实验动物中心、基础医学院、河北省慢性疾病重点实验室及唐山市慢性病临床基础研究重点实验室完成的,在药物提取及制备过程中白明刚老师给予很大帮助及支持,在此一并表示衷心感谢!)
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