糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是一种巨噬细胞激活介导的慢性炎症性疾病[1, 2]。在糖尿病的高糖环境中，体内游离氨基之间发生非酶促糖基化反应，最终生成晚期糖基化终末产物(AGEs)。研究表明，AGEs的聚集增加可诱发巨噬细胞的活化，是导致DN发生发展的重要原因。转化生长因子β激活激酶1(TAK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路上游炎症和免疫信号途径的共同关键调节子[3]。有研究表明，MAPK和NF-κB信号通路是参与巨噬细胞激活的细胞内信号转导途径[4, 5]。但是TAK1是否参与AGEs诱导巨噬细胞活化及其机制研究，目前尚未见报道，本实验以BMMs为研究对象，体外模拟糖尿病肾病病理状态，观察TAK1抑制剂对BMMs中相关信号通路蛋白及炎症因子的影响，探讨TAK1信号通路在AGEs诱导巨噬细胞激活中的具体机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级♂ C57BLKS/J小鼠24只，同窝清洁级♂野生对照小鼠12只，6~8周龄，体质量30~40 g，南京大学动物模式中心，动物合格证号：SCKX(苏)2010-0001。
1.2 药品与试剂AGEs、牛血清白蛋白(BSA)(北京博奥森生物技术公司)，胎牛血清(FBS)，RPMI 1640(加拿大WISENT公司)，小鼠成纤维细胞L929(中科院上海细胞库)，5Z-7-oxozeaenol(美国EMD Billerica公司)，抗鼠F4/80抗体，抗鼠/人CD11b抗体，抗鼠CD11c抗体(美国Bio Legend公司)，TRIzol试剂(美国Life Technology公司)，荧光定量试剂盒(美国Bio-Rad公司)，RT-PCR引物(上海，生工)，兔抗p-TAK1多克隆抗体、兔抗TAK1多克隆抗体、兔抗TAB1多克隆抗体、鼠抗ED-1单克隆抗体(美国Abcam公司)、小鼠抗p-p38MAPK单克隆抗体、兔抗p38MAPK多克隆抗体、兔抗NF-κB p65多克隆抗体(美国Cell Signaling公司)、兔抗MCP-1多克隆抗体、兔抗TNF-α多克隆抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体、辣根酶标记羊抗兔IgG、辣根酶标记羊抗小鼠IgG(武汉三鹰生物技术公司)
2 方法 2.1 骨髓来源巨噬细胞提取C57小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，分离并剪断股骨及胫骨的两端，用含2%FBS的冷PBS冲洗出骨髓，过筛离心后加入红细胞裂解液，冰上孵育10min；再以4℃离心5 min；弃上清，使用RPMI 1640培养基+15%L929上清+10%FBS+双抗培养基重悬细胞后计数，细胞浓度调整至1×109 cells·L-1接种到6孔板，于5% CO2，37℃孵箱中培养。7 d后，0.25%胰酶消化并收集非贴壁细胞。
2.2 流式细胞术分析BMMs纯度无血清培养基同步化BMMs 24 h，200 mg·L-1 AGEs刺激24 h后收集[6]，经离心洗涤，加入抗小鼠CD16/32Fcγ受体20min阻断细胞膜上Fc受体；再加入FITC标记的F4/80抗体，APC标记的CD11b和PE标记的CD11c，避光室温孵育30 min，离心洗涤2次，重悬于500 μL PBS中，使用美国BD FACS Calibur流式细胞仪分别检测F4/80、CD11b和CD11c阳性细胞百分比。
2.3 抑制剂对巨噬细胞活力影响按照CCK-8(cell counting kit)细胞毒性试剂盒说明书进行，取BBMs对数期生长细胞(每孔1×104)接种于96孔板，同步化培育24 h，分别加入不同浓度(10~1 000 nmol·L-1)的TAK1抑制剂或DMSO(对照组)，37℃孵育1 h后，AGEs干预24 h；每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h；用酶标仪测490 nm处各孔吸光度，重复3次，计算平均细胞活力。
2.4 实时荧光定量PCR检测各组巨噬细胞的MCP-1及TNF-α mRNA的表达选TAK1抑制剂浓度30、100及300 nmol·L-1，作用于AGEs刺激的BBMs，分别加入1 mL TRIzol试剂，提取总RNA，进行RNA纯度和浓度鉴定，使OD260/OD280在1.8~ 2.0之间；将RNA通过反转录系统A3500逆转录成cDNA，采用SYBR Green PCR试剂盒进行PCR测定。GAPDH:上游序列5′- GGTGAAGGTCG GTGTGAACG-3′，下游序列5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′;TNF-α:上游序列5′-GCTGAGCTCAAACCCTGGTA-3′，下游序列5′-CGGACTCCG CAAAGTCTAAG-3′;MCP-1:上游序列5′-TTGACCCGTAAATCTGAAG CTAAT-3′，下游序列5′-TCACAGTCCGAGTCACACTAGTTCAC-3′。每个样本设3个复孔，取均值，获得平均Ct值，以GAPDH作为内参照校正，用2-△△Ct法分析基因的相对表达。
2.5 巨噬细胞实验分组通过预实验摸索最佳抑制剂浓度为300 nmol·L-1，及各组蛋白表达最佳时间点。细胞培养至70%~80%融合时，同步化24 h，进行细胞分组：正常对照组(normal control，NC，RPMI 1640培养基)；BSA组(200 mg·L-1BSA，BSA)；AGEs组(200 mg·L-1 AGEs，AGEs)；AGEs+OZ组(200 mg·L-1 AGEs+OZ300)。
2.6 激光共聚焦显微镜分析将BMMs以1×105/孔的密度接种在玻璃皿底，4%多聚甲醛4℃下固定10 min，5%驴血清白蛋白阻断2 h，加入抗iNOS抗体4℃孵育过夜。PBST洗3次后，加入Alexa Fluor 647标记的F4/80和FITC标记的二抗避光孵育2 h，DAPI染核，漂洗封片后，在德国Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜下观察采像。
2.7 Western blot检测各组的蛋白表达AGEs刺激同步化后的巨噬细胞，相应的时间点收集蛋白；并将蛋白电转移至NC膜，使用丽春红染色判断有无条带，将NC膜取出并置于TBST配制的5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h；加入p-TAK1抗体(1 :1 000)、TAK1(1 :1 000)、TAB1(1 :1 000)、pJNK(1 :1 000)、JNK(1 :2 000)、p-p38MAPK(1 :1 000)、p38MAPK(1 :2 000)、NF-κBp65(1 :1 000)、β-actin抗体(1 :2 000)、4℃过夜；洗膜后加入用TBST稀释的辣根酶过氧化物标记的羊抗兔IgG(1 :2 000)，37℃孵育45 min；洗膜3次后使用ECL反应30 s，在Tanon 4500SF成像系统中显影。用Tanon公司LabWorks 4.5软件对Western blot条带进行半定量分析。以β-actin作为内参照，所有的结果至少重复3次。
2.8 统计学分析实验数据用x± s 表示，方差齐性检验用Levene法，统计学处理应用单因素方差分析，组间差异检验采用LSD分析。
3 结果 3.1 骨髓来源巨噬细胞纯度鉴定L929细胞上清液中含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，加入小鼠骨髓来源干细胞，d 7时，诱导成BMMs，经流式细胞仪检测巨噬细胞表面标记物F4/80和CD11b，双标阳性率达到99.35%(Fig 1)。
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| Fig 1 Purity detection of bone marrow derived macrophages |
选取10 nmol·L-1到1 000 nmol·L-1之间5种抑制剂浓度，Fig 2表明5Z-7-oxozeaenol浓度在10~300 nmol·L-1对AGEs刺激的BMMs活性无影响(P＞0.05)，5Z-7-oxozeaenol 1 000 nmol·L-1时对AGEs刺激的BMMs活性有影响(P <0.05)。
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| Fig 2 Viability analysis of BMMs after treatment with 5Z-7-oxozeaenol (10~1 000 nmol·L-1) in AGEs-induced BMMs *P < 0.05 vs AGEs group (AGEs). |
RT-PCR结果显示，与对照组比较，AGEs刺激组BMMs MCP-1和TNF-α的mRNA表达明显上调(P <0.01)，这一结果表明AGEs可以增加巨噬细胞炎症因子的产生；随5Z-7-oxozeaenol浓度(30、100、300 nmol·L-1)的升高，MCP-1、TNF-α mRNA表达呈下降趋势，其中300 nmol·L-1的5Z-7-oxozeaenol对炎症因子抑制作用最强(P <0.01)，故5Z-7-oxozeaenol可以降低AGEs诱导的BMMs炎症因子的表达，见Fig 3。
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| Fig 3 Real time PCR analyses effects of OZ on MCP-1 and TNF-α mRNA expression of BMMs under AGEs **P < 0.01 vs normal group (NC)；#P < 0.05，##P < 0.01 vs AGEs group (AGEs). |
Fig 4A系激光共聚焦显微镜分析结果，提示AGEs组iNOS荧光强度明显高于对照组，AGEs+OZ300组iNOS荧光强度明显减弱；但F4／80在所有组别的BMMs上均表达。流式细胞术显示，AGEs组的F4/80、CD11b和CD11c三标的M1型巨噬细胞百分比较对照组明显升高(P <0.01)，说明AGEs刺激可成功诱导BMMs功能表型向M1型活化；AGEs+OZ300组M1型巨噬细胞百分比明显降低(P <0.01)，提示5Z-7-oxozeaenol可抑制AGEs对巨噬细胞的活化作用，见Fig 4B。
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| Fig 4 Effects of 5Z-7-oxozeaenol on macrophage activation in AGEs-induced BMMs A：Effects of 5Z-7-oxozeaenol on expression of the macrophage cytoplasmic markers. The markers were measured by confocal microscopy. Double staining with F4/80 and iNOS. B：Effects of 5Z-7-oxozeaenol on expression of the macrophage surface markers. The markers of F4/80，CD11b，and CD11c was measured by FCM. **P < 0.01 vs normal group (NC);#P < 0.05 vs AGEs group. |
Western blot印迹条带分析显示AGEs组p-TAK1、p-JNK、p-p38MAPK、TAB1和NF-κB p65蛋白表达较对照组增加(P <0.05)，5Z-7-oxozeaenol干预可使巨噬细胞上述蛋白表达与AGEs组相比下降(P <0.05)，见Fig 5。
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| Fig 5 Effects of OZ on p-TAK1，TAB1，p-JNK，p-p38MAPK protein in AGEs-induced BMMs analysed by Western blot *P < 0.05 vs normal group (NC);#P < 0.05 vs AGEs group. |
巨噬细胞的活化和浸润是DN炎症反应的特征性表现之一。经典激活型(classically activated，M1型)巨噬细胞是促炎及促纤维化的巨噬细胞表型，在早期炎症反应阶段，浸润的巨噬细胞通过分泌IL-12、IL-23、TNF-α、IL-1β、活性氧(ROS)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及MCP-1等促炎因子引起的肾脏组织结构的损伤和破坏，参与DN间质炎症反应及肾小球纤维化的发生[7]。糖尿病环境下生成的AGEs可以通过与细胞表面特异性受体结合，激活氧化应激及MAPK、NF-κB等信号传导途径，诱导细胞因子的表达及细胞外基质的聚集，导致肾小球纤维化、炎性细胞浸润和蛋白尿产生[8, 9, 10]。故巨噬细胞的活化和AGEs的聚集与DN发生发展有着密切的关系。本实验采用AEGs孵育巨噬细胞24 h，模拟体外糖尿病肾病炎症状态。F4/80、CD11b表示巨噬细胞的成熟度，iNOS和CD11c在活化的巨噬细胞中高表达，可作为M1型巨噬细胞表面标志[11]。激光共聚焦显示AGEs组上述M1型巨噬细胞表面标志的百分比明显高于对照组，说明AGEs刺激可成功诱导BMMs向M1型巨噬细胞分化。作为免疫反应的主要效应细胞，M1型巨噬细胞产生多种炎性细胞因子，如TNF-α和IL-1β，TNF-α具有介导生长、炎症、免疫调节等多方面生物学效应[12]。最近的一项研究显示，在单核/巨噬细胞中，AGEs通过上调mRNA水平并释放促炎细胞因子IL-1β和TNF-α，进而诱导人单核细胞表达单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，它对单核巨噬细胞具有很强的趋化激活作用[12, 13, 14]。前期预实验结果显示，10、30、100及300 nmol·L-1的5Z-7-oxozeaenol对AGEs刺激的BMMs活性无影响，在安全剂量范围内选用30、100及300 nmol·L-1 3种浓度作用于AGEs刺激的BMMs，RT-PCR法检测炎症因子TNF-α、MCP-1的表达，较AGEs组均有降低(P <0.05)，其中300 nmol·L-1时的炎症因子的表达最弱(P <0.01)，故后期的实验分组中5Z-7-oxozeaeno的浓度选为300 nmol·L-1，而AGEs+OZ300组M1型巨噬细胞表面标志较AGEs组明显降低(P <0.01)，提示5Z-7-oxozeaenol可抑制AGEs刺激的巨噬细胞的活化及TNF-α和MCP-1的产生，但具体的分子机制尚不清楚。
TAKl为苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，在序列与功能上属于丝裂原激活蛋白激酶家族成员。TAK1作为调节多种促炎因子信号转导通路，在促炎因子，如TNF-α、IL-1β、TGF-β、Toll样受体(TLR)配体的参与下，首先通过激活MAP2Ks家族的MEK3/6和MEK4/7，然后MEK3/6和MEK4/7信号分别激活MAPK家族的应激活化激酶(JNK)、p38MAPK激酶进而激活转录因子激活蛋白1(AP-1)[15]。TAK1又可以通过与结合蛋白TAB1的共表达而被激活，磷酸化修饰被认为是TAK1依赖的信号转导过程中重要调节机制[16]。NF-κB是转录因子家族中的成员，被AGEs产生的ROS激活，与靶基因上特定的DNA序列结合并调节基因转录，产生和释放各种细胞因子，如MCP-1及TNF-α等，后者可进一步增加ROS的产生，二者形成级联反应，构成恶性循环，导致NF-κB活性持续升高[17, 18]。Hofmann等[19]的研究发现，DN患者外周血单个核细胞NF-κB的活性较DM患者明显增强，并与蛋白尿程度相关，表明NF-κB活性与DN的发生及其程度密切相关。在UUO致肾小管间质纤维化小鼠模型中，JNK、p38MAPK、NF-κB信号通路在肾脏组织被激活以及下游的炎症因子IL-1α、TNF-α、NOS2和CCL2mRNA表达增加，同时巨噬细胞浸润明显增加。利用基因敲除技术使UUO小鼠模型TAK1基因敲除，结果JNK、p38MAPK、NF-κB信号通路被抑制，炎症因子的释放减少以及巨噬细胞的浸润明显降低[8]。体内研究表明，TAK1抑制剂可以阻止损伤导致的TAK1和NF-κBp65的磷酸化[20]，TAK1基因敲出小鼠细胞的TNFR1、IL-1R和TLR3通路功能缺陷，下游信号NF-κB、JNK和IKKβ不能被激活[21]。因此，TAK1基因在调节JNK、p38MAPK和NF-κB通路及其下游炎症因子的表达上发挥重要作用。本实验通过Western blot法探讨TAK1抑制剂对BMMs中TAK1、MAPK和NF-κB信号通路的影响，与对照组相比较，AGEs组的p-TAK1、TAB1表达明显升高，同时JNK、p38MAPK及NF-κB的磷酸化水平均增加，给予300 nmol·L-1 TAK1抑制剂治疗后，上述信号通路蛋白的表达均降低，说明TAK1通过磷酸化介导在调节MAPK及NF-κB信号通路中发挥至关重要的作用。
综上所述，本研究模拟体外糖尿病病理环境，AGEs可以激活巨噬细胞中TAK1、MAPK及NF-κB信号通路，初步证实TAK1抑制剂可以干预巨噬细胞MAPK及NF-κB信号转导通路的活化以及炎症因子TNF-α、MCP-1的表达，从而抑制糖尿病炎症反应，且为临床上控制糖尿病炎症的激活提供理论基础。但是TAK1、MAPK及NF-κB信号通路之间是否存在相互作用，以及肾脏巨噬细胞分离进一步验证TAK1在糖尿病肾病中的作用机制需要进一步的探讨。
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