2. 山东中医药大学附属医院内分泌科, 山东济南 250011
2.Dept of Endocrinology, the Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan
糖尿病可累及肝脏缺血缺氧,ALT、AST活性增加,胆红素代谢紊乱,重者可致肝坏死[1, 2];肝损伤又使血糖难控制,二者恶性循环,致糖脂代谢紊乱。有实验证明,肝纤维化等慢性肝病时,TLR4可经NF-κB信号转导通路致肝损伤。本实验采用STZ+TAA造成DM急性肝损伤大鼠模型,观察糖肝康对模型大鼠肝脏TLR4免疫组化表达的影响。
1 材料 1.1 动物及分组健康♂ Wistar大鼠200只,体质量(200±20) g,由山东中医药大学实验动物中心提供。取Wistar大鼠190只,用2%链脲佐菌素制成糖尿病模型。选取150只成模大鼠进入实验,随机分3大组(n=50):TAA 100、200、300 mg·kg-1组;每种造模方式随机分5小组(n=10):模型动物+生理盐水组、模型动物+护肝宁组、模型动物+糖肝康小、中、大剂量组。另取10只正常大鼠作为正常动物+生理盐水组。
1.2 药物及试剂糖肝康颗粒:山东中医药大学附属医院药剂科加工,实验时将颗粒水煎煮开后制成糖肝康煎剂;护肝宁:贵州信邦制药股份有限公司,批号20120303041。链脲佐菌素(STZ):Sigma公司产品,批号020106;硫代乙酰胺(TAA):上海展云化工有限公司,批号1106017;一抗Anti-TLR4,北京博奥森生物技术有限公司,批号bs-1375R;SP-9000 HistostainTM-Plus kits免疫组化染色试剂盒,批号20090921,浓缩型DAB试剂盒,批号20091021,均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 仪器LXJ-Ⅱ型离心沉淀机,上海第二分析仪器厂生产;LEICA ASP600全自动生物脱水机,LEICA公司生产;OLYMPUS CX51显微镜;LEICA ASP2135病理切片机;医学图像分析系统,型号HPIAS1000,同济医科大学千屏影像工程公司产品。
2 方法 2.1 给药模型动物+生理盐水组和正常动物+生理盐水组给予生理盐水ig;模型动物+护肝宁组给予护肝宁混悬液0.04 g·mL-1 ig;模型动物+糖肝康小、中、大剂量组分别给予1、2、4 g·mL-1的糖肝康ig。各组给药容积均为10 mL·kg-1。
2.2 造模连续给药12周后,TAA 100、200、300 mg·kg-1组分别给予TAA 100、200、300 mg·kg-1腹腔注射,制成糖尿病急性肝损伤模型。
2.3 免疫组化检测TLR424 h内用戊巴比妥钠60 mg·kg-1腹腔注射,取血,待测血糖、肝功能。开腹取出肝脏,严格根据免疫组化试剂盒操作,检测肝脏TLR4的表达。
2.4 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件,应用单因素方差分析,以x±s表示。
3 结果 3.1 糖肝康对TAA急性肝损伤模型大鼠血糖、肝功能的影响造模后,模型动物+生理盐水组大鼠的血糖、ALT、AST水平异常升高,与正常动物+生理盐水组相比(P < 0.01)。治疗后,模型动物+糖肝康小、中、大剂量组和模型动物+护肝宁组与模型动物+生理盐水组相比,血糖、ALT、AST水平降低(P < 0.05或P < 0.01)。模型动物+糖肝康大剂量组与模型动物+护肝宁组比较,血糖、ALT、AST水平降低(P < 0.05)。模型动物+糖肝康中剂量组与模型动物+护肝宁组比较,ALT水平降低(P < 0.05)。
3.2 糖肝康对TAA急性肝损伤模型大鼠肝脏TLR4免疫组化表达的影响正常动物+生理盐水组大鼠肝脏KC、血管内皮细胞、胆管上皮细胞及一些肝细胞有微弱TLR4表达。造模后,模型动物+生理盐水组大鼠肝组织TLR4表达明显增加,TLR4染色位于胞质,主要见于窦周,以沿间隔分布的梭形间质细胞表达为主,部分肝细胞、肝窦内皮细胞和胆管上皮细胞的膜上TLR4的表达也有所增强。治疗后,与模型动物+生理盐水组比较,模型动物+糖肝康中、大剂量组窦周梭行间质细胞表达减少,模型动物+护肝宁组和模型动物+糖肝康小剂量组TLR4阳性颗粒表达也减少,模型动物+糖肝康用药组与模型动物+护肝宁组比较,无明显差异。
4 讨论糖尿病肝损伤与氧化应激、炎症因子等因素密切相关。TLR4信号通路激活后,能启动多种炎症因子的转录和合成[3]。已证明,TLR4通过MyD88依赖性信号通路和MyD88非依赖性信号通路激活NF-κB[4, 5],NF-κB参与免疫调控介导炎症和多种生理病理过程的基因转录[6],导致炎性因子大量表达,参与机体组织、器官的损害。结果显示,模型动物+生理盐水组大鼠血糖、肝功能及肝脏TLR4的表达较正常动物+生理盐水组大鼠明显异常,而糖肝康可改善TLR4在肝脏的表达,对血糖、肝功能的效果优于模型动物+护肝宁组。此外,本研究通过研究糖肝康对不同TAA剂量所致糖尿病急性肝损伤的治疗,效果无差别;且糖肝康与护肝宁相比,差异也无显著性。但糖肝康可明显改善血糖、肝功能,也可降低肝脏TLR4的表达,进而起到保护肝脏的作用。
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