娄建石(1954-),男,硕士,教授,博士生导师,研究方向:心血管药理学,通讯作者,Tel:022-83336860,E-mail:jianshilou@163.com
心力衰竭在临床上可分为急性心力衰竭和慢性心力衰竭[1],严重时可导致意识模糊甚至昏迷,并最终产生心源性休克。同时,心衰所致的电生理重构往往造成心肌动作电位时程延长[2, 3, 4],继而延长QT间期,这又会增加恶性心律失常发生的风险而诱发猝死等。故随着人们对其危害性的普遍认知,心衰的防治策略越来越受瞩目。目前,临床上心衰的治疗主要是应用地高辛、洋地黄毒苷等具有正性肌力作用的强心苷类药物[5],但是其在增加心肌收缩力的同时易引起室早、室速等心律失常,且增加心脏的负担,而未能改善心衰患者的预后并降低其死亡率[6]。因此,探索更加安全有效的抗心衰药物仍是今后研究的难点与热点。
我们发现不少研究[7, 8, 9, 10]证实,天然甾体皂苷薯蓣皂苷(dioscin,Dio)具有抗炎、抗肿瘤和抗骨质疏松等多种药理作用。本室前期实验研究亦发现Dio对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护效应[11],而且其在细胞水平可通过调节心肌钠、钙等离子通道而发挥抗缺氧/复氧诱导的心律失常作用。更为重要的是,我们前期研究还发现其具备一定的强心作用,且尚未见文献报道。因此,我们设想与强心苷类同属于甾体苷类的Dio产生的正性肌力作用是否与其相同?是否比其更低毒更安全?本实验将进行初步探索,以期揭示Dio作用特点和机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验对象健康、成年Wistar 大鼠,♂,体质量250~300 g,合格证号SCXK(京)2012-0004,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供;大鼠心肌细胞 H9c2 细胞株,购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。
1.1.2 药品与试剂Dio购自国家天然药物研究中心;JC-1和Fluo3-AM 钙离子荧光探针购自碧云天生物技术研究所。
1.1.3 仪器GL-2 Langendorff 灌流装置、BL420-F生物机能实验系统,成都泰盟软件有限公司,中国;PHS-3C酸度计,上海精密科学仪器有限公司,中国;Millipore纯水系统,美国;OLYMPUS全电动倒置荧光显微镜,日本;Gemini XPS荧光读板机,美国。
1.1.4 液体的配制K-H灌流液(mmol·L-1):NaCl 118.06、KCl 4.69、MgSO4 1.18、CaCl2 2.5、NaHCO3 25、KH2PO4 1.18、Glucose 11.11,预充混合氧(95% O2+5% CO2)后调节pH至7.4。
1.2 方法 1.2.1 离体心脏Langendorff灌流法用25%乌拉坦麻醉大鼠,仰位固定于鼠台上,迅速剪开胸腔,暴露心脏,从主动脉根部离断取心脏,放入4℃生理盐水中去除脂肪及结缔组织。将主动脉逆行插管,以恒温(37℃)、充氧(95% O2+5% CO2)的K-H液8 mL·min-1灌流,灌注压为8~9 kPa左右。待心脏逐渐恢复跳动且残血排尽后,剪掉左心耳,将球囊压力感受器探头经左心房插入左心室。压力感受器经压力换能器与 BL420生物机能实验系统相连以记录左心室收缩曲线,采样频率为800点·s-1。心脏灌流稳定30 min,给药前5 min作为空白对照,然后给予药物干预。给药后20 min观察记录左心室各项心功能指标。
1.2.2 细胞内钙离子浓度的测定以8×107·L-1的密度将细胞接种于共聚焦培养皿中,于孵箱中培养24 h后,与药液共孵育20 min。后加入Fluo3-AM工作液负载30 min,后用台氏液洗涤细胞3遍,向各组加入1 mL台氏液,避光孵育20~30 min。共聚焦显微镜下记录荧光信号,利用Image J软件计算胞内平均荧光强度。
1.2.3 线粒体膜电位的测定以 4~5×107·L-1的密度将细胞接种于24孔板,接种48 h后用PBS冲洗2遍,给予相应含药培养基孵育20 min。后用PBS冲洗1遍,换上终浓度1.5 mg·L-1 JC-1孵育20 min;孵育完成后,用PBS冲洗2遍,加入DMEM,放入酶标仪检测荧光值。
1.2.4 实验分组① 正常对照组;② 低浓度0.1 μmol·L-1 Dio组;③ 中浓度1 μmol·L-1 Dio组;④ 高浓度10 μmol·L-1 Dio组。
1.2.5 统计学分析数据以x±s表示,采用SPSS 21.0软件进行配对t检验和单因素方差分析,方差齐时,多组间比较用LSD法;方差不齐时,采用Dunnett T3法。
2 结果 2.1 Dio对大鼠离体心脏左心室各心功能指标的影响以给药前5 min作为正常对照,采用配对t检验比较各组给药前后各心功能指标差异。由BL-420系统记录到的左心室压力图像(Fig1)。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1 Dio使LVSP明显增加近13%和18%(P < 0.01);+dP/dtmax增加约11%和9%(P < 0.05),同时HR减慢;10 μmol·L-1 Dio则使LVEDP 明显增加(P < 0.01),而LVSP等其他指标均明显降低(P < 0.01),且实验过程中偶见心律失常。各浓度Dio下参数具体变化见Fig2中给药后各参数与正常对照的比值。
2.2 Dio对大鼠心肌细胞内钙离子浓度的影响Dio作用后Ca2+荧光强度变化如Fig3和Fig4所示。与正常对照组相比,0.1、1和10 μmol·L-1 Dio均能使荧光强度增强(P < 0.01),其中1 μmol·L-1 Dio效应最明显,使荧光强度增加约56.25%。
2.3 Dio对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响Dio作用后荧光比值变化如Fig5所示。与正常对照组相比,0.1、1 μmol·L-1 Dio孵育均未引起荧光比值明显变化(P>0.05)。但10 μmol·L-1 Dio使该比值增加约18.42%(P < 0.01),显示该组线粒体膜电位降低。
3 讨论本实验分别探索了Dio对心肌收缩力和细胞内Ca2+浓度的作用,低、中浓度Dio可使LVSP和+dP/dtmax明显增加,体现正性肌力作用。研究证实,舒张性心力衰竭患者,左室射血分数正常而-dP/dtmax明显降低。Dio可增加-dP/dtmax,在一定程度上改善左心室舒张功能,相较于传统的正性肌力药更有优势。
然而,高浓度Dio对心肌收缩力的作用却与低、中浓度相反,使LVSP和±dP/dtmax均减小,仅增加LVEDP。在实验过程中,在刚刚给予高浓度Dio时(5 min内),可观察到LVSP有所增加,但随着灌流时间的延长,LVSP开始降低,甚至出现心律失常,这可能与高浓度Dio过分增加LVEDP,使得容量负荷过度有关。
心肌收缩功能与细胞内Ca2+水平密切相关[12, 13]。我们由当前研究发现Dio的急性作用可使Ca2+荧光强度增强,这表明Dio与洋地黄强心苷类药物作用方式相似,即通过增加心肌细胞内Ca2+浓度而发挥正性肌力作用。这引发了我们对于Dio在提升细胞内Ca2+水平的同时是否会导致钙超载,以及其诱导Ca2+浓度增加的机制产生了思考。
首先,线粒体膜电位的测定结果显示,低、中浓度Dio对荧光比值无明显改变,即不由此引发细胞损伤。同时,其仅在10倍于中浓度的高浓度下才使该比值有一定升高,这与离体水平上高浓度的不良效果较为一致。但是与洋地黄毒苷类强心药易引发心律失常,增加心脏负荷相比,Dio似乎仍显示出更优的安全性,因为在1 μmol·L-1浓度时,Dio增加细胞内Ca2+浓度和心肌收缩力在本实验中最明显,而此时并未见心律失常以及钙超载所致的线粒体膜电位下降,显示出Dio在发挥正性肌力作用上可能具备一定优势。
其次,细胞内Ca2+浓度的增加表明Dio并非如左西孟坦等钙增敏剂,通过增加心肌收缩蛋白对Ca2+的敏感性来发挥强心作用[14]。另外,我们前期实验又证实Dio可减少L-型Ca2+通道介导的内向钙电流[15],这表明L-型Ca2+通道不是Dio增加Ca2+浓度的途径。因此,其机制有待于进一步研究。再有,我们前期结果还显示Dio能够增加内向钠电流[16]。联想到临床上使用的洋地黄类药物通过抑制心肌Na+-K+-ATP酶活性,使细胞内Na+增多,从而通过钠钙交换体(sodium-calcium exchanger,NCX)使细胞Ca2+内流增加,产生正性肌力作用[17]。Flesch等[18]也认为,钠通道激活剂产生正性肌力作用的机制与钠钙交换活动增强有关。另外,进入细胞的Ca2+也可触发肌浆网释放Ca2+[19]。我们据此推测,Dio增强心肌收缩力的作用可能与影响钠钙交换体相关。因此,下一步我们将观察Dio是否通过上述机制增加胞内Ca2+浓度以证明我们的设想。
总之,我们证实Dio通过增加胞内Ca2+浓度产生正性肌力作用,还能改善舒张功能,仅高浓度时才产生一定的钙超载,基本符合理想正性肌力药的要求[20]。当然,本实验目前仅初步发现Dio的正性肌力作用,还尚未对其作用原理进行深入探究,故今后我们将从多途径,如NCX电流以及进出肌浆网的Ca2+浓度变化等进行观察以阐明其机制。同时,Dio对病理情况下心肌收缩力的作用也亟待探索。
[1] | McMurray J J, Adamopoulos S, Anker S D, et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012[J]. Eur J Heart Fail, 2012, 14(8):803-69. |
[2] | Shi C, Wang X, Dong F, et al, Temporal alterations and cellular mechanisms of transmural repolarization during progression of mouse cardiac hypertrophy and failure[J]. Acta Physiol (Oxf), 2013, 208(1):95-110. |
[3] | Song B, Wang B N, Chen D N, et al. Myocardial remodeling and bioelectric changes in tachycardia-induced heart failure in dogs[J]. Braz J Med Biol Res, 2013, 46(9):797-802. |
[4] | Coltart D J, Meldrum S J. Hypertrophic cardiomyopathy. An electrophysiological study[J]. Br Med J, 1970, 4(5729):217-8. |
[5] | Heasley B. Chemical synthesis of the cardiotonic steroid glycosides and related natural products[J]. Chemistry, 2012, 18(11):3092-120. |
[6] | Nieminen M S, B hm M, Cowie M R, et al. Executive summary of the guidelines on the diagnosis and treatment of acute heart failure:the Task Force on Acute Heart Failure of the European Society of Cardiology[J]. Eur Heart J, 2005,26(4):384-416. |
[7] | Tao X, Wan X, Xu Y, et al. Dioscin attenuates hepatic ischemia-reperfusion injury in rats through inhibition of oxidative-nitrative stress, inflammation and apoptosis[J]. Transplantation, 2014, 98(6):604-11. |
[8] | 张春芳, 吴 珊, 彭金咏, 等. 薯蓣皂苷通过上调Lrp5、β-catenin表达促进成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(9):1255-60. Zhang C F, Wu S, Peng J Y, et al. Dioscin stimulates proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblasts via upregulation of Lrp5 and β-catenin expression[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29(9):1255-60. |
[9] | 何 焱, 王继双, 张 鹏, 等. 薯蓣皂苷元药理作用及其机制研究进展[J]. 中草药, 2013, 44(19):2759-65. He Y, Wang J S, Zhang P, et al. Research progress on pharmacological properties of diosgenin and its mechanism[J]. Chin Tradit Herbal Drugs, 2013, 44(19):2759-65. |
[10] | Tong Q, Qing Y, Wu Y, et al. Dioscin inhibits colon tumor growth and tumor angiogenesis through regulating VEGFR2 and AKT/MAPK signaling pathways[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2014, 281(2):166-73. |
[11] | 高卫真, 王 玮, 范晓静, 等. 薯蓣皂苷对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国分子心脏病学杂志, 2008, 8(2):72-4. Gao W Z, Wang W, Fan X J, et al. The protective effect of dioscin on cultured cardiomyocytes treated by hypoxia/reoxygenation[J]. Mol Card China, 2008, 8(2):72-4. |
[12] | Wang M, Xu X, Xu H, et al. Effect of the total saponins of Aralia elata (Miq) Seem on cardiac contractile function and intracellular calcium cycling regulation[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 155(1):240-7. |
[13] | Duan J, Esberg L B, Dai S, et al. Comparison of cardiac contractile and intracellular Ca2+ response between estrogen and phytoestrogen alpha-zearalanol in ventricular myocytes[J]. Endocrine, 2004, 24(1):33-8. |
[14] | Palmerini E, S derberg S, Mondillo S, et al. Effects of levosimendan on heart failure in normotensive patients:does loading dose matter[J]. Acute Card Care, 2015, 17(1):14-19. |
[15] | 张铭慧, 尹永强, 何海燕, 等. 薯蓣皂苷对大鼠心室肌细胞钙离子通道的影响[J]. 中药药理与临床, 2011, 27(1):23-6. Zhang M H, Yin Y Q, He H Y, et al. Effects of dioscin on calcium channels in rats ventricular cardiomyocyte[J]. Pharmacol Clin Chin Mater Med, 2011, 27(1):23-6. |
[16] | 刘 静, 吴 红, 丛恬駪, 等. 薯蓣皂苷含药血清对大鼠心室肌细胞钠离子通道的影响[J]. 中草药, 2014, 45(16):2370-4. Liu J, Wu H, Cong T S, et al. Effects of serum containing dioscin on sodium channel in rat cardiomyocytes[J]. Chin Tradit Herbal Drugs, 2014, 45(16):2370-4. |
[17] | Kaneko Y, Nakajima T, Irie T, et al. Ventricular fibrillation following bidirectional tachycardia due to digitalis toxicity[J]. Intern Med, 2011, 50(19):2243. |
[18] | Flesch M, Erdmann E. Na+ channel activators as positive inotropic agents for the treatment of chronic heart failure[J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2001, 15(5):379-86. |
[19] | Neco P, Rose B, Huynh N, et al. Sodium-calcium exchange is essential for effective triggering of calcium release in mouse hear[J]. Biophys J, 2010, 99(3):755-64. |
[20] | 徐 毅, 罗卓卡, 黄霏霏, 等. 正性肌力药物作用靶点的研究进展[J]. 中国新药杂志, 2012, 21(3):268-72. Xu Y, Luo Z K, Huang F F, et al. Progress in research of the targets for inotropic agents[J]. Chin J New Drug, 2012, 21(3):268-72. |