长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA) 是指长度超过200nt 的RNA分子[1]，主要形式是以RNA的形式、不编码蛋白，其主要功能包括在表观遗传水平、转录水平以及转录后水平等多种层面上调控基因的表达，与多种人类疾病的发生有密切的关系。某些特定的lncRNA在多种肿瘤组织和细胞株中表达异常，可能为恶性肿瘤分子诊断和治疗提供依据和靶点[2]。MALAT1基因(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1)是在研究人非小细胞肺癌的转移中发现的新的长链非编码RNA基因[3]，定位人类11q13染色体上。近年发现MALAT1与肝癌关系密切，抑制MALAT1在肝癌细胞HepG2的表达可以有效降低细胞活力、运动、侵袭等[4]，可能成为肿瘤治疗的新靶点[5]。蜂毒素(Melittin)是蜂毒的主要活性部分，可以阻滞肿瘤细胞的增殖和诱导凋亡，有望用于临床的肿瘤治疗，然而其抗肿瘤的分子机制尚未完全明确。本研究通过构建针对MALAT1 RNA的小干扰RNA(small interfeting RNA,siRNA)，特异沉默MALTA1的表达，观察对蜂毒素诱导的HepG2增殖抑制和细胞凋亡作用的影响，为临床治疗提供新的思路与理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人正常肝细胞株L0-2和人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海细胞研究所。
1.1.2 试剂与仪器蜂毒素Melittin购于上海吉尔公司，MTT试剂盒购于Sigma公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，培养基购于Hyclone公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购于BestBio公司，逆转录试剂盒购于TaKaRa公司，Real-time Quantitative PCR (RT-qPCR) 试剂盒QuantiTect SYBR Green PCR Kits购于Qiagen公司，TRIzol Reagent、脂质体LipofectamineTM 2000、Opti-MEM购于Invitrogen 公司。引物合成均由上海生工生物工程公司提供。二氧化碳培养箱(Thermoforma)，酶标仪(BiotecEL)，流式细胞仪(Beckman)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养细胞培养采用DMEM培养基(含10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1 链霉素)，细胞培养条件为37℃、5% CO2、饱和湿度，细胞为贴壁生长，胰蛋白酶消化后传代，实验时调整细胞状态为对数生长期。
1.2.2 MTT法检测蜂毒素对细胞的增殖抑制① 实验分组：阴性对照组、蜂毒素(1、4和8 mg·L-1)3个浓度组。用完全培养基稀释对数生长期细胞至4×108·L-1，将细胞悬液接种于96孔板中，培养12 h后细胞贴壁后换液，加入含不同浓度蜂毒素(1、4和8 mg·L-1)的培养基100 μL，阴性对照组加入等量培养基。设6个复孔。蜂毒素作用48 h。② 实验分组：空白对照组、蜂毒素组(4 mg·L-1)、蜂毒素(4 mg·L-1)+阴性对照组、蜂毒素(4 mg·L-1)+MALAT1 siRNA组。用完全培养基稀释对数生长期细胞至4×108·L-1，将细胞悬液接种于96孔板中，培养24 h细胞贴壁后加入转染复合物100 μL进行转染，转染6 h后，各组加入含蜂毒素(4 mg·L-1)的完全培养基100 μL，空白组加入等量培养基。蜂毒素作用48 h。以上两个分组中，每孔加入MTT 溶液(5 g·L-1)20 μL，继续孵育4 h 后吸去上清，加入DMSO 150 μL，振荡5~10 min，待蓝色晶体完全溶解后，酶标仪上492 nm测定吸光度。按以下公式计算生长抑制率：抑制率/%=(对照组A值－实验组A值)/对照组A值×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测凋亡率细胞凋亡定量分析采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒。① 实验分组：空白对照组、蜂毒素(1、4和8 mg·L-1)3个剂量组。用完全培养基稀释细胞至4×108·L-1，将细胞悬液接种至培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养12 h，细胞贴壁后换液，分别给予蜂毒素(1、4和8 mg·L-1)，作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，低速离心收集细胞。 ② 实验分组：空白对照组、蜂毒素组(4 mg·L-1)、蜂毒素(4 mg·L-1)+阴性对照组、蜂毒素(4 mg·L-1)+MALAT1 siRNA组。HepG2细胞常规培养至对数生长期，将细胞以4×105接种于6孔板中，24 h左右待细胞贴壁后转染，转染后6 h更换为含血清的完全培养基，并各组加入蜂毒素(4 mg·L-1)2 mL，空白组不进行处理。蜂毒素作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，低速离心收集细胞沉淀。在以上两个分组中，在收集的细胞沉淀中加入400 μL Binding Buffer 混悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀后，于2~8 ℃ 避光条件下孵育15 min，加入10 μL PI后轻轻混匀，于2~8 ℃避光条件下孵育5 min。流式细胞仪常规检测。
1.2.4 siRNA的合成根据siRNA设计原则，设计针对MALAT1的siRNA序列，在GenBANK表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的唯一性，靶向目的MALAT1的序列设计两条序列。siRNA1正义链：5′-GAUCCAUAAUCGGUUUCAAGGTT-3′，反义链：5′-CCUUGAAACCGAUUAUGGAUCTT-3′；siRNA2正义链：5′-CACAGGGAAAGCGAGUGGUUGGUAATT-3′，反义链：5′-UUACCAACCACUCGCUUUCCCUGUGTT-3′。同法构建阴性对照组，两条DNA链的正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，与任何编码序列无同源性，上海吉玛制药有限公司合成有效siRNA干粉制剂。
1.2.5 转染实验分为空白组、阴性对照组、MALAT1 siRNA1组、MALAT1 siRNA2组。用完全培养基稀释对数生长期细胞至4×108·L-1，接种于6 孔板中，常规培养24 h后，调整细胞密度为50% ~80%。在200 μL Opti-MEM中加入5 μL LipofectamineTM 2000，室温孵育5 min后，在200 μL Opti-MEM中加入5 μL siRNA；将上述两种稀释液混匀成转染复合物，室温孵育20 min。分别配制阴性对照siRNA、siRNA1、siRNA2组转染复合物。将6孔板中的细胞培养液弃去，PBS清洗1遍，将2 mL Opti-MEM加入空白组；1.6 mL Opti-MEM加入阴性对照组、MALAT1 siRNA1组、MALAT1 siRNA2，再加入对应的上述转染复合物；轻轻摇匀，置于培养箱常规培养，6 h后更换为含胎牛血清的完全培养基，蜂毒素可在换液后加入。
1.2.6 Real-time Quantitative PCR方法检测MALAT1表达水平细胞总RNA提取采用TRIzol试剂盒操作指南。提取得到的总RNA按TaKaRa试剂盒操作指南，取2 μL总RNA，2 μL Primer Mix，6 μL Water反转录成cDNA。取3 μL cDNA，2 μL引物，5 μL SYBGREEN体系进行PCR反应。PCR条件按Qiagen试剂盒操作：MALAT1：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共进行45个循环；60 ℃ 30 s；升至95℃采集熔解曲线数据。重复实验3次。引物序列：内参为β-actin，上游：5′-CCCACACTGTGCCCA TCTACG-3′，下游：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC C-3′；MALAT1上游：5′-AAAGCAAGGTCTCCCCA CAAG-3′，下游：5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGG CA-3′。采用PikoReal 96 Real-Time PCR软件对实验结果进行分析。
1.3 统计学分析实验数据以 x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析处理，两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用ANOVA单因素方差分析。
2 结果 2.1 蜂毒素对HepG2细胞增殖的抑制作用MTT实验结果显示，与空白对照组相比，蜂毒素各浓度组(1、4、8 mg·L-1)处理48h的细胞增殖抑制率均明显升高，如Fig 1所示。随着药物浓度加大，抑制率逐渐增高，呈现出浓度依赖性。
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| Fig 1 Inhibitory effects of Melittin on proliferation of HepG2 cells *P<0.05, **P<0.01 vs control |
药物处理48 h后，蜂毒素各浓度组均能诱导HepG2细胞凋亡，并呈现一定的浓度依赖性。1、4、8 mg·L-1蜂毒素作用细胞48 h后，细胞凋亡率明显高于正常对照组(P<0.01)，如Fig 2所示。
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| Fig 2 Effects of Melittin on cell apotosis of HepG2 cells A:Control group；B-D:HepG2 cells were treated with various concentrations of Melittin(1,4,8 mg·L-1);E:Histogram. **P<0.01 vs control |
通过qPCR检测可以看出，与人正常肝细胞株L0-2相比，MALAT1 mRNA在HepG2细胞株上相对高表达，二者之间差异比较具有统计学意义(P<0.01)，如Fig 3所示。
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| Fig 3 mRNA expression levels of MALAT1 in HepG2 and L0-2 cells **P<0.01 vs L0-2 cell line |
用不同剂量的蜂毒素对HepG2细胞进行处理后，检测其MALAT1的表达情况。1、4、8 mg·L-1的蜂毒素处理后的MALAT1 mRNA表达量明显下降，并呈浓度依赖性，如Fig 4所示。提示蜂毒素可明显抑制HepG2细胞中MALAT1 mRNA的表达。
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| Fig 4 Effects of Melittin on MALAT1 mRNA expression in HepG2 cells *P<0.05, **P<0.01 vs control |
表达 用两种MALAT1特异性siRNAs(siRNA1、siRNA2)沉默HepG2细胞中的MALAT1，相对于阴性对照组，siRNAs均可使MALAT1 mRNA的表达明显降低，如Fig 5所示，其中MALAT1-siRNA2效果更为明显，用于后续实验研究。
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| Fig 5 Effects of siRNAs on MALAT1 mRNA level in HepG2 cells *P<0.05, **P<0.01 vs negative control |
选取中等剂量4 mg·L-1的蜂毒素处理HepG2细胞同时沉默MALAT1，MTT结果显示，与单独给予蜂毒素组比较，siRNA2沉默MALAT1能促进蜂毒素诱导的HepG2细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05)，如Fig 6所示。流式细胞检测结果显示，给予蜂毒素同时沉默MALAT1能促进细胞凋亡率升高更明显(P<0.01)，如Fig 7所示。结果提示沉默MALAT1能有效促进蜂毒素对HepG2细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡。
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| Fig 6 Inhibitory effects of Melittin and MALAT1-siRNA2 on proliferation of HepG2 cells 1:Control；2: Melittin(4 mg·L-1)；3: Melittin(4 mg·L-1)+negative siRNA；4: Melittin(4 mg·L-1)+MALAT1-siRNA2. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs Melittin(4 mg·L-1) + negative siRNA group. |
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| Fig 7 Effects of Melittin and MALAT1-siRNA2 on apotosis of HepG2 cells A:Control；B: Melittin(4 mg·L-1)；C: Melittin(4 mg·L-1)+negative siRNA；D: Melittin(4 mg·L-1)+MALAT1-siRNA2;E:Histogram.**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Melittin(4 mg·L-1)+negative siRNA group. |
长链非编码RNA可在肿瘤细胞中特异性地表达，与癌症的发生发展密切相关[6, 7]。MALAT1位于细胞核核小体的核心区，该区域参与基因的聚集、修饰、储存和加工，在基因表达调控上具有重要作用[8]。 MALAT1可在细胞水平调节丝氨酸精氨酸蛋白(SR)磷酸化模式，从而对剪接进行调节[9]。研究表明MALAT1在肝癌细胞中高表达，抑制MALAT1可降低肝癌细胞HepG2的侵袭力并增加细胞凋亡的敏感性[4]，作用机制可能是通过干扰转移相关基因与凋亡途径而实现的。已有研究指出抑制MALAT1可上调caspase-3、caspase-8和Bax而下调Bcl-2 和Bcl-xL[10]。
我国是全球肝癌新增病例和死亡人数最多的国家，深入研究治疗肝癌的药物具有非常重要的意义。蜂毒素是从蜂毒中提取出来的肽类物质，具有杀菌、抗炎和镇痛作用，能诱导多种肿瘤细胞凋亡。蜂毒素抗肿瘤分子机制仍然不清楚，需要深入探讨研究。目前发现其具有多方面机制[11, 12, 13, 14]，如通过影响caspases途径，最终激活caspase-3导致细胞凋亡；通过调控Bcl-2家族蛋白，使Bcl-2/Bax降低，使细胞凋亡；通过促进Ca2+内流活化CaMKII-TAK1-JNK/p38途径，并抑制IKK-NF-κB途径诱导肝癌细胞凋亡，并能通过这种方式增强细胞对凋亡诱导剂TRAIL的敏感性。蜂毒素是否能协同或通过长链非编码MALAT1途径促进细胞凋亡值得研究，为疾病的预测、诊断和治疗提供新的分子依据。
本实验研究了蜂毒素对HepG2细胞的增殖抑制和促凋亡作用，MTT显示蜂毒素各浓度组(1、4和8 mg·L-1)处理48h的细胞增殖抑制率均明显升高，呈现出浓度依赖性关系。流式细胞检测能诱导HepG2细胞凋亡，并呈现一定的浓度依赖性。通过qPCR检测发现MALAT1在HepG2细胞株上存在高表达，而用蜂毒素处理48 h后可明显抑制MALAT1的表达，并呈浓度依赖性，可能的机制是蜂毒素可影响肿瘤细胞周期，将其阻滞于G2/M 期，从而减少了MALAT1基因的表达，这一假设有待于进一步的实验验证。鉴于目前RNA沉默技术在肿瘤治疗中越来越受到重视，我们也采取两种MALAT1特异性siRNAs(siRNA1、siRNA2)来沉默HepG2细胞中的MALAT1，结果表明二者均可使MALAT1的表达量明显降低。通过对比，我们用下调效果更为明显的siRNA2与蜂毒素(4 mg·L-1)共同作用于HepG2细胞。 MTT与流式细胞仪结果显示，与单独给予蜂毒素组比较，siRNA2沉默MALAT1同时给予蜂毒素的细胞的抑制率和凋亡率升高更明显，提示沉默MALAT1可以促进蜂毒素诱导的HepG2细胞增殖抑制与细胞凋亡，其中机制可能和影响凋亡信号通路(如Bcl-2家族、caspases家族)有关，这是我们下一步工作的方向。
综上所述，本研究证实了蜂毒素对人肝癌细胞株HepG2促凋亡作用，同时发现蜂毒素还可降低HepG2细胞中MALAT1的表达，体外实验表明对MALAT1进行沉默可促进蜂毒素诱导细胞凋亡的敏感性，提示二者联用有相对高的抗癌作用，为临床用药提供新的思路，其作用机制还有待于进一步阐明。
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