白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)是机体重要的贮存脂肪、调节能量代谢平衡的组织。在WAT中，脂质的合成与分解效率直接呈正相关[1]。机体内脂肪需进行不断地更新：一方面，外源性的脂肪通过血浆转运，以游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)的形式进入脂肪细胞，再合成脂肪储存；另一方面，储存的脂肪不断分解，以FFA的形式进入各组织，然后被氧化利用供能，使脂肪代谢保持动态平衡。进食过多的热量可促进甘油三酯(triglyceride，TG)的合成导致肥胖，而超重或肥胖者体内的脂肪堆积使脂肪分解更加活跃，释放更多的FFA，血中FFA增加引发血脂紊乱，抑制葡萄糖利用，降低胰岛素敏感性，继而诱发胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢综合征。
树豆(Cajanus cajan L. Millspaugh)是蝶形花科木豆属多年生灌木。研究表明，其菧类提取物能有效降血糖，并降低血清和肝脏的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平，改善高脂血症[2, 3]。树豆酮酸A是从树豆提取物中分离出来的一种菧类化合物，该化合物对高糖高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的2型糖尿病SD大鼠及自发性肥胖伴高血糖高血脂模型(Zucker fa/fa大鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠)均能起到减轻体重，降低血糖、血脂，增强胰岛素敏感性的作用[4]。但其作用机制尚未明确。有鉴于此，我们在本研究中以小鼠3T3-L1前脂肪细胞诱导分化WAT细胞为模型，研究树豆酮酸A对脂肪细胞脂质代谢的影响。
1 材料 1.1 细胞株3T3-L1前脂肪细胞株由香港城市大学生物及化学实验室惠赠。
1.2 试剂与仪器高糖Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)细胞培养液、胎牛血清：美国Gibco公司；CCK8：美国Sigma-aldrich公司，批号FJ692；液体样品甘油含量Glycerophosphate oxidase- Peroxidase (GPO-POD) 酶法测定试剂盒：普利莱基因有限公司，批号E1002； TG测定试剂盒、FFA测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为：20150611、20150311；Revertra First Strand cDNA Synthesis Kit、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix：日本TOYOBO公司，批号分别为：451100、453300；ABI 7500实时荧光定量PCR仪：美国应用生物系统公司；Thermo Scientific MK3型酶标仪：Thermo Fisher 公司；CK40倒置光学显微镜：美国Olympus公司。引物的设计和合成：上海生工生物技术有限公司。
2 方法 2.1 细胞培养及分化诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞株，用培养基(含10%胎牛血清的高糖DMEM)，在37℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔培养板中，待细胞汇合后接触抑制48 h，换用含0.5 mmol·L-1 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、0.25 μmol·L-1 dexamethasone(DEX)和10 mg·L-1胰岛素的培养基培养48 h。然后换用含10 mg·L-1胰岛素的培养基培养48 h，再换用培养基继续培养，每2天换液1次，诱导分化至d 8细胞 90%以上呈脂肪细胞表型。
2.2 CAA分离与鉴定树豆叶粗粉经乙醇提取，依次经石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部位经柱层析分离得到CAA，核磁共振谱和质谱鉴定。
2.3 CCK8测定细胞生存率3T3-L1前脂肪细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔培养板中，当细胞融合率达到60%~70%后，换成含0(空白对照组)、25、50、100 μmol·L-1 CAA的培养基孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK8继续孵育1.5 h，震荡混匀，酶标仪检测450 nm波长吸收值A。存活率/%=(药物组A值-调零A值)/(空白组A值-调零A值)×100%，计算细胞存活率。
2.4 油红O测定细胞总脂量3T3-L1前脂肪细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔培养板，按“2.1”方法诱导分化为成熟的脂肪细胞后，添加0(空白对照组)、25、50、100 μmol·L-1 CAA，并设未分化组进行对照。48 h后，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞3次，10%福尔马林固定20 min，PBS 清洗3次晾干，每孔加入100 μL油红O 染色液静置20 min，倒掉染色液，以PBS 洗2次，除去多余染料，倒置显微镜下拍照。然后每孔加入150 μL异丙醇，震荡1 min，酶标仪检测492 nm 波长吸收值A。
2.5 TG、甘油、FFA测定细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔培养板，同“2.4”加入CAA处理48 h后，取各孔培养液，分别用试剂盒检测FFA、TG和甘油含量。
2.6 实时荧光定量PCR检测基因表达收集细胞并裂解，按说明书提取RNA。取2 μg RNA，按Revertra First Strand cDNA Synthesis kit说明书进行逆转录，合成cDNA，然后以其为模板加入引物、ROX Referencedye和Thunderbird SYBR qPCR Mix，以β-actin基因为内参，按照说明书进行实时荧光定量PCR分析。实验所用引物序列如Tab 1所示。
| Gene | Genebank No. | Primer sequence (5′→3′) | Productsize/ bp |
| β-ACTIN | NM007393 | Forward:CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC | 171 |
| Reverse:ATGGAGCCACCGATCCACA | |||
| ATGL | NM025802 | Forward:GTCACCAACACCAGCATCC | 122 |
| Reverse: CGAAGTCCATCTCTGTAGCC | |||
| HSL | NM010719 | Forward: ACTGAGATTGAGGTGCTGTC | 138 |
| Reverse:AGGTGAGATGGTAACTGTGAG | |||
| LPL | NM008509 | Forward: GCCCAGCAACATTATCCAGT | 168 |
| Reverse:GGTCAGACTTCCTGCTACGC | |||
| CPT-1 | NM013495 | Forward: CACTGCAGCTCGCACATTAC | 135 |
| Reverse: CCAGCACAAAGTTGCAGGAC | |||
| ACC | NM133360 | Forward: GAGAGGGGTCAAGTCCTTCC | 152 |
| Reverse:ACATCCACTTCCACACACGA | |||
| ACOX | NM015729 | Forward: AAAAACCTTCAGGCCCAAGT | 215 |
| Reverse: CCTTTCTGGCTGATCCCATA | |||
| FAS | NM007988 | Forward: CTGAGGACTTCCCAAACGG | 228 |
| Reverse:TGGCCTGATGAAACGACAC |
采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析比较组间差异，实验数据用 x±s表示。
3 结果 3.1 CAA对3T3-L1细胞增殖的影响实验中以不同浓度CAA(25、50、100 μmol·L-1)作用3T3-L1前脂肪细胞48 h后，细胞存活率分别为99.97%、101.36%和93.25%，与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见Tab 2。表明CAA终浓度在25~100 μmol·L-1范围内对3T3-L1前脂肪细胞增殖无影响。
| ( x±s,n=12) | ||
| Group | CAA/μmol·L-1 | Survival rate/% |
| Control | 0 | 100 |
| CAA | 25 | 99.97±2.96 |
| 50 | 101.36±1.68 | |
| 100 | 93.25±11.06 | |
根据CCK8结果，使用25、50、100 μmol·L-1 CAA作用已诱导分化成熟的脂肪细胞，油红O脂类染色法检测细胞脂质合成。镜检显示，未分化的3T3-L1前脂肪细胞呈梭状，而分化成熟的脂肪细胞呈圆形。随着CAA添加浓度的增高，脂肪细胞变小，油红O沉淀也依次减少。以异丙醇溶解细胞内沉淀的油红O，采用酶标仪进行定量检测。与前脂肪细胞比较，分化成熟的脂肪细胞A值明显升高(P<0.01)，表明脂肪含量明显增加；添加CAA处理48 h后，脂肪含量则明显下降(P<0.01)，见Tab 3。与CAA减少脂肪细胞总脂质含量的结果一致，CAA同样抑制脂肪细胞TG的生成，与不加CAA对照组比较差异有 显著性(P<0.05,Tab 4)。结果表明，CAA具有明显抑制脂肪细胞脂肪合成的作用，且随剂量增加而作用增强。
| ( x±s，n=12) | ||
| Group | CAA/μmol·L-1 | A492 |
| P< 0.01 vs preadipocytes；**P< 0.01 vs the group of adipocytes without CAA treatment. | ||
| Undifferentiated cells(preadipocytes) | 0 | 0.16±0.01 |
| Differentiated cells(adipocytes) | 0 | 0.45±0.01## |
| 25 | 0.39±0.02** | |
| 50 | 0.34±0.03** | |
| 100 | 0.30±0.01** | |
| ( x±s，n=12) | ||||
| Group | CAA/μmol·L-1 | TG/μmol·L-1 | Glycerin/μmol·L-1 | FFA/μmol·L-1 |
| —：Undetected.##P< 0.01 vs preadipocytes；*P<0.05，**P<0.01 vs the group of adipocytes without CAA treatment | ||||
| Undifferentiated cells (preadipocytes) | 0 | - | - | 137.33±10.01 |
| Differentiated cells (adipocytes) | 0 | 499.35±59.24 | 622.16±19.37 | 833.00±164.33## |
| 25 | 393.93±55.48* | 616.68±31.53 | 687.30±45.32 | |
| 50 | 392.82±64.51* | 571.82±47.32** | 598.86±45.43* | |
| 100 | 380.06±55.39* | 547.80±33.58** | 484.53±64.02** | |
如Tab 4所示，与对照组比较，CAA低剂量组(25 μmol·L-1)可减少脂肪细胞甘油和FAA的释放，但无统计学意义。CAA 中剂量和高剂量组(50、100 μmol·L-1)作用浓度能明显抑制甘油FAA的释放，且与对照组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。结果表明，CAA对脂肪细胞的脂肪分解有抑制作用。
3.4 CAA对脂肪代谢相关基因表达水平的影响实验定量检测了ACC和FAS(脂肪酸从头合成关键酶)、LPL(与脂肪酸吸收相关)、ATGL和HSL(TG分解的限速酶)、ACOX和CPT-1(脂肪酸氧化限速酶)编码基因的mRNA水平，发现与未分化的前脂肪细胞比较，脂肪细胞ACC、FAS、LPL、ATGL、HSL、ACOX、CPT-1表达水平均大幅提升(P<0.01，Fig 1)，表明由于脂肪细胞内脂代谢活跃，其相关基因表达也相应提高。CAA作用后，ACC、FAS、LPL、ATGL、HSL mRNA水平明显下降(P<0.05或P<0.01，Fig 1)，与CAA对脂肪细胞脂肪合成与分解的抑制作用一致。但CPT-1、ACOX mRNA表达水平明显提高(P<0.05或P<0.01，Fig 1)，提示CAA可能对脂肪酸氧化有促进作用。
|
| Fig 1 Effects of CAA on mRNA levels of genes related to lipid metabolism( x±s，n=4) P< 0.01 vs preadipocytes；*P<0.05，**P<0.01 vs the group of adipocytes without CAA treatment |
本研究观察了树豆酮酸A对脂肪细胞脂质合成与分解的作用，结果显示，树豆酮酸A明显抑制TG的合成，并明显抑制甘油和FFA的释放。TG在体内合成所需的脂酰CoA，主要有两种来源：一是以乙酰CoA为原料的从头合成途径，ACC和FAS是参与合成的两个关键酶；二是脂肪酸碳链延长的合成途径，通过吸收血液中的FFA或利用细胞中TG分解的FFA，由脂酰CoA合成酶催化合成脂酰CoA，实现FFA再酯化。血液中的乳糜微粒和极低密度脂蛋白所携带的TG在LPL催化下降解为甘油和FFA，后者通过细胞表面的CD36途径进入细胞。因此，LPL在细胞获取FFA过程中起关键作用[5]。而HSL和ATGL则是脂肪细胞内TG水解的限速酶[6]。本研究的结果显示，树豆酮酸A通过下调ACC、FAS、LPL、HSL和ATGL的表达，从而抑制脂肪细胞内两条TG合成途径，减少TG等脂质合成，并抑制TG降解，减少甘油和FFA的释放。
在脂肪细胞分化早、中期阶段，LPL、ACC和FAS的表达量依次明显增高，细胞内的脂质合成加速，使脂肪细胞体积增大。到脂肪细胞分化成熟时，HSL和ATGL的表达也会明显提高，提示细胞内脂肪分解也开始变得活跃[7]。因此，脂肪细胞的脂质合成与分解维持着一种动态平衡，当脂肪积累超出负荷时，脂质分解会增加，引起FFA升高、高甘油三脂血症，使人体糖脂代谢紊乱。在减少脂肪细胞脂质合成的同时，抑制脂解更有利于维持更健康的能量代谢平衡。有资料显示，抑制ATGL与HSL的表达与活性可有效抑制脂解反应，改善代谢综合征[8, 9]。通过节食或锻炼使体重下降，其HSL表达也随之下降，相应地FFA也会减少[10]。特异性敲除小鼠脂肪细胞的ATGL基因，在抑制脂解、降低血脂的同时，与脂肪吸收、合成相关基因表达也受到抑制，肝胰岛素信号通路增强，葡萄糖耐受性得到改善[11]。LPL与脂蛋白中TG的降解及FFA吸收密切相关，其生理效应具有组织特异性差异。脂肪组织特异性LPL减少或缺失可减少先天肥胖ob/ob小鼠的脂肪储存[12]。另有研究表明，下调WAT中LPL和FAS的表达，可有效抑制脂肪细胞的过度肥大[13]。
本研究的结果还显示，树豆酮酸A上调ACOX和CPT-1的mRNA水平。ACOX和CPT-1是FFA β氧化过程的限速酶，其表达量提高提示树豆酮酸A对脂肪细胞的脂肪酸氧化可能有促进作用。在脂酰CoA从头合成途径中，ACC催化乙酰CoA产生丙二酰CoA(malonyl-CoA)。以往的研究表明，丙二酰CoA可通过抑制CPT-1而抑制脂肪酸氧化。ACC表达下降可活化CPT-1，从而在抑制脂肪合成的同时，促进脂肪酸氧化和葡萄糖吸收[14, 15]。脂肪酸再酯化贮能、脂肪酸氧化供能是脂肪酸代谢的两个方面，当脂肪酸再酯化能力下降，FFA富余的情况下，高效的脂肪酸氧化有助于维持细胞内能量平衡[16]。如有研究显示，长时间中低强度运动会抑制内脏与皮下脂肪细胞脂质合成与分解，同时促进脂肪酸氧化参与供能，将体内储能的WAT，转化为提供能量的褐色脂肪[1]。
综上所述，树豆酮酸A通过下调ACC、FAS、LPL、HSL、ATGL，上调ACOX、CPT-I的表达，抑制脂肪细胞TG的合成与分解、促进脂肪酸过氧化，减少FFA的释放，起到减肥降脂的作用。令人惊喜的是，树豆酮酸A还具有改善地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗、增加糖消耗的作用；在体内也显示良好的降血糖、血脂，减肥作用[4]。其治疗肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病的开发前景值得期待。
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