2. 华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系, 药物靶点研究及药效学评价湖北省重点实验室, 湖北 武汉 430000
2. Dept of Pharmacology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Key Laboratory of Drug Target Research and Pharmacodynamic Evaluation of Hubei Province, Wuhan 430000, China
炎症反应是组织受到病原感染、外伤等刺激后产生的病理生理反应。通常情况下，炎症反应是先天免疫系统为清除有害刺激并促进组织修复的一种保护措施，然而不可控的慢性炎症对机体会再次造成损伤。宿主主要通过两类模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)介导细胞内炎症介质的释放，启动炎症反应：一类是膜结合受体，如Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)，其可识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，主要是指不同微生物所具有的某些高度保守结构，包括肽聚糖(PGN)、细菌脂多糖(LPS)、病毒双链DNA、真菌细胞、鞭毛蛋白壁等[1]；另一类主要是细胞内NOD样受体 (nucleotide-binding oligomerzation domain like receptors,NLRs)，其主要识别损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)，包括进入细胞内的外源性病原体成分以及一些内源性分子(如细胞死亡后释放的ATP、尿酸结晶、胆固醇结晶、石棉等)[2]。
炎症小体(inflammasome)是一种调控IL-1β产生的大分子多蛋白复合体，由Tschopp研究小组于2002年首次提出[3]。该蛋白复合体包含一个PRR，以NLRs和AIM2样受体[an absent in melanoma 2(AIM2)-like receptor]家族为代表。NLRs是一种进化上高度保守的胞质受体家族，其结构为：中间是NOD(nucleotide binding and oligomerization,NACHT)结构域，能介导自身寡聚反应；N端是热结构域(pyrin domain,PYD)或caspase募集结构域(caspase recruitment domain,CARD)，可介导下游信号转导；C端为亮氨酸富集结构域 (leucine-rich repeat,LRR)，用于识别配体。目前为止，NLR基因在人类发现有23种，小鼠中有34种，根据系统进化分析NACHT结构域，将人NLR划分为3个家族[3](Fig 1)：NODs家族，包括NOD1-2、NOD3/NLRC3、NOD4/NLRC5、NOD5/NLRX1和CIITA；NLRPs/NALPs家族，包括NLRP1-14；IPAF家族，包括NLRC4/IPAF和NAIP。AIM2样受体家族蛋白结构为：N端是PYD，C端有一个或两个HIN-200(hematopoietic interferon-inducible nuclear antigens with 200 amino acid repeat)DNA结合域，也称为PYHIN家族[pyrin and HIN200(haematopoietic interferon- inducible nuclear antigens with 200 amino-acid repeats)domain-containing protein]，人类中发现该家族包含4种蛋白：IFI16、IFIX、MNDA和AIM2。
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| Fig 1 NLR family members The NLR family has been grouped into three distinct subfamilies: the NODs (NOD1-2, NOD3/NLRC3, NOD4/NLRC5, NOD5/NLRX1, and CIITA), the NLRPs/NALPs (NLRP1-14), and the IPAF family (NLRC4/IPAF and NAIP). NLR: nucleotide-binding oligomerzation domain like receptor. |
NLRP3(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat protein 3)炎症小体被研究的最为深入和广泛，其由感受蛋白NLRP3、衔接蛋白ASC(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD)和炎症相关蛋白激酶caspase-1组成(Fig 2)。 NLRP3被激活之前，其受到SGT1和HSP90调控处于自身抑制状态，NLRP3配体与NLRP3的LRR区结合后，NACHT结构域发生自身寡聚化，PYD结构域招募ASC分子激活caspase-1；活化的caspase-1剪切Pro-IL-1β生成活化的IL-1β。NLRP3炎症小体可被多种刺激激活，比如细胞外ATP、胆固醇结晶、铝盐及病原体等[4, 5, 6]。
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| Fig 2 The NLRP3 inflammasome The NLRP3 inflammasome is composed of the NLRP3 sensor, the ASC adaptor, and caspase-1. NLRP3: nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat protein 3; ASC: apoptosis associated speck-like protein containing a CARD; PYD: pyrin domain; NACHT: nucleotide-binding and oligomerization domain; LRR: leucine-rich repeat; CARD: caspase recruitment domain. |
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病，由于大多数AS相关病变中并不存在微生物感染，所以AS相关炎症实属无菌炎症[7]。研究认为，无菌炎症主要是由炎症小体活化，诱导细胞分泌IL-1β等促炎因子介导[2, 7, 8]。大量临床及基础研究显示，IL-1β在AS发生发展中发挥重要作用。研究发现，某些内源性代谢相关分子，比如葡萄糖[9]、胰岛淀粉样多肽[10]、胆固醇结晶[11]、氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)[12]、神经酰胺[13]均可被巨噬细胞及其他类型细胞胞质内分子模式受体NLRP3识别，最终诱导NLRP3炎症小体组装活化，促进IL-1β等炎症因子释放，加重炎症反应。慢病毒siRNA尾静脉注射沉默ApoE-/-小鼠NLRP3基因后发现，AS进展减缓，促炎因子生成减少，AS斑块内巨噬细胞和脂质减少，平滑肌细胞和胶原增多，斑块稳定性增强[14]。Duewell等[12]认为，与LDLR-/-小鼠相比，西方高胆固醇饮食喂养的NLRP3-/-/LDLR-/-、ASC-/-/LDLR-/-、IL-1α/β-/-/LDLR-/-小鼠，AS斑块面积明显减小。临床研究发现，NLRP3炎症小体在AS患者的动脉中高水平表达，NLRP3炎症小体的表达水平与冠脉狭窄程度和心血管疾病的临床风险因素(吸烟、高血压、糖尿病、高胆固醇血症等)正相关。最新文献表明[15]，大剂量瑞舒伐他汀通过下调急性心梗和不稳定型心绞痛患者外周血单核细胞内NLRP3、组织蛋白酶B(cathepsin B,CB)及IL-1β释放水平，有效调控AS相关炎症反应。
IL-1β通过与受体IL-1R结合发挥作用。IL-1R拮抗剂(IL-1Ra)是一种急性时相反应蛋白，通常伴随IL-1β出现，其通过与 IL-1竞争结合IL-1R抑制IL-1β信号，但对细胞不产生其他作用。研究发现，IL-1Ra在人AS病变动脉、LPS及佛波酯处理过的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、人冠脉内皮细胞、人冠脉平滑肌细胞中均有表达。Elhage等[16]发现，高胆固醇饮食喂养的♂或♀ ApoE-/-小鼠，短期给予人工合成的IL-1Ra后能减少AS脂纹形成。Chi等[17]发现，较IL-1R+/+/ApoE-/-小鼠，IL-1R-/-/ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养24周后，AS进程明显减缓。Isoda等[18]发现，在AS早期，与IL-1Ra+/+/ApoE-/-小鼠相比，IL-1Ra+/-/ApoE-/-小鼠动脉斑块形成增多；但在AS后期，两种小鼠动脉斑块面积并无明显差异。更重要的是，在AS斑块进展过程中，IL-1Ra水平较低或者缺乏会促使斑块内聚集更多的巨噬细胞，较少的平滑肌细胞。
巨噬细胞是IL-1β的重要来源，绝大多数炎症小体相关的研究主要围绕巨噬细胞展开。然而，血管平滑肌细胞和内皮细胞也可以产生少量的IL-1β和其他细胞因子，因此这些细胞也可能表达炎症小体相关蛋白，并能激活炎症小体。总而言之，炎症小体在AS病变中发挥重要作用。本文主要通过总结AS相关细胞(内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞)与NLRP3炎症小体之间的关系来探讨NLRP3炎症小体在AS病变发生发展中的作用。
1 NLRP3炎症小体与血管内皮细胞内皮细胞(endothelial cells,ECs)功能障碍被认为是AS病变中最早发生的事件。组织炎症反应的重要特点是ECs活化后募集炎症细胞。据报道[19, 20]，ECs可以合成IL-1β。已有研究发现，人AS内皮细胞中IL-1β表达上调。
研究发现，HUVECs合成的IL-1β水平为THP-1细胞的1/10~1/50；静息状态或给予炎性刺激后，HUVECs均可持续表达Pro-caspase-1。Wilson等[20]发现，LPS处理后HUVECs可检测到Pro-IL-1β，但是IL-1β水平较低；再用TNF-α处理,P2X7R表达明显上调，Pro-IL-1β表达水平达高峰，IL-1β水平明显增加。LPS与ATP共处理却不能促进IL-1β释放。IL-1β和TNF-α共处理后IL-1β水平也明显上调。HUVECs经腺病毒转染嘌呤受体P2X7R后，TNF-α预处理再加入ATP，IL-1β水平明显增加。Wilson等[20]认为，炎性刺激可以诱导HUVECs胞质内形成一个完整的炎症小体并释放较低水平IL-1β，机制之一与ECs表达低水平的P2X7R有关，同时也不能排除其他刺激促进HUVECs产生较高水平的IL-1β。Schonbeck等[21]发现，人工合成的人CD40配体(rCD40L)可以促进人隐静脉血管ECs合成Pro-IL-1β，激活caspase-1，促进IL-1β释放。另有报道表明[22]，ox-LDL可剂量依赖性地促进兔新生血管内膜表达和释放IL-1β。
AS病变主要发生在大血管及血管分叉等血流变化大的部位，这些部位异常的血液流动及低剪切力会诱导血管ECs中IL-1β、NADPH氧化酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2,NOX2)基因表达增加，炎症反应和氧化应激增强，加重AS病变。Xiao等[23]发现，异常血流通过激活HUVECs中固醇调节元件结合蛋白2[sterol regulatory element (SRE) binding protein 2,SREBP2]促进NLRP3炎症小体活化，上调NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平，促进IL-1β分泌释放。体内脂质代谢的稳定依赖于SREBP的调节，其通过与脂质合酶基因的启动子/增强子的固醇调节元件结合，提高靶基因转录活性，并特异性调控胆固醇和脂肪酸代谢。动物实验进一步发现,ApoE-/-/EC-SREBP2(N)-Tg小鼠较ApoE-/-小鼠更易形成AS，斑块面积是ApoE-/-小鼠的1.5倍。Yang等[24]发现，原花青素B2可抑制LPS诱导的HUVECs中NLRP3炎症小体活化，caspase-1活性及IL-1β水平降低，相关机制与原花青素抑制LPS上调活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平及AP-1转录活性有关。芒果苷也可通过有效降低内皮细胞内ROS水平，抑制IRE1α磷酸化，降低内质网应激相关氧化应激水平，下调硫氧还原蛋白-互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)表达，抑制NLRP3炎症小体活化及IL-1β释放[25]。近期发现，干酪乳杆菌细胞壁成份(lactobacillus casei cell wall extract,LCWE)可促进冠脉内皮细胞中NLRP3炎症小体组装，诱导caspase-1活化及IL-1β释放。沉默NLRP3或给予溶酶体膜稳定剂(秋水仙碱、地塞米松、神经酰胺)均可以抑制NLRP3炎症小体活化[26]。然而，也有研究发现用外周动脉疾病患者的血清处理人主动脉ECs后，细胞功能紊乱主要与NLRP1炎症小体活化有关[27]；分析认为，不同细胞给予不同刺激，细胞内激活的炎症小体类型可能会有所不同。
2 NLRP3炎症小体与巨噬细胞外周血单核细胞浸润是AS斑块的主要特征之一。单核巨噬细胞一旦活化会释放大量细胞因子，加重血管炎症反应。体内研究发现，巨噬细胞是IL-1β的重要来源。多种PAMPs和DAMPs均可以激活巨噬细胞。
AS病变从脂纹到进展性斑块，斑块内的胆固醇结晶随着病变进展明显增加。胆固醇晶体会影响AS斑块的僵硬度及稳定性。Rajamaki等[11]报道，激光共聚焦显微镜观察发现人巨噬细胞能够吞噬胆固醇结晶，胆固醇酯在细胞内大量蓄积。更为重要的是，胆固醇晶体通过活化NLRP3炎症小体，浓度依赖性诱导人单核细胞和人巨噬细胞释放成熟的IL-1β。沉默巨噬细胞中NLRP3蛋白后可以完全抑制胆固醇晶体诱导的IL-1β分泌。进一步研究发现，胆固醇晶体激活NLRP3炎症小体的机制可能与细胞内K+外流、溶酶体中组织蛋白酶B漏入胞质有关。Duewell等[12]也证实，胆固醇晶体诱导的NLRP3炎症小体活化与巨噬细胞内溶酶体破裂，组织蛋白酶释放有关。细胞吞噬功能抑制剂(细胞松弛素D、Lantriculin A)、组织蛋白酶活性抑制剂均可有效拮抗胆固醇晶体诱导NLRP3炎症小体活化，促IL-1β释放的作用。
Ox-LDL在AS斑块内沉积滞留是AS发生的中心事件。巨噬细胞摄取ox-LDL后转化为泡沫细胞，释放多种促炎介质，促进AS病变发生发展。Liu等[28]发现，ox-LDL可诱导巨噬细胞释放IL-1β，促进泡沫细胞形成，加速AS病变进展。IL-1β抗体或者IL-1Ra抑制IL-1β功能后，ox-LDL诱导形成的泡沫细胞数量明显减少。有报道表明[29]，ox-LDL通过结合巨噬细胞表面CD36受体，促进细胞产生ROS，进而激活下游NLRP3炎症小体，激活caspase-1，促进IL-1β释放。ROS抑制剂乙酰半胱氨酸(NAC)可以完全抑制IL-1β产生，NOX2抑制剂只能部分抑制巨噬细胞产生IL-1β。Bauernfeind等[30]发现，ox-LDL通过激活NF-κB，上调Pro-IL-1β表达水平，NF-κB特异性抑制剂Bay-11-7082能明显降低Pro-IL-1β蛋白的表达水平。同时，Jiang等[29]发现，巨噬细胞吞噬ox-LDL后会通过诱导NLRP3炎症小体活化，促进细胞分泌大量炎症因子IL-1β，相关机制与ROS水平和组织蛋白酶B活性增加有关。另外，研究发现，轻度修饰的LDL也可激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体，促进IL-1β分泌释放[12]。
在人冠脉AS斑块内，CD31+内皮细胞及CD68+巨噬细胞内高表达P2X7R。沉默P2X7R后，ox-LDL诱导的巨噬细胞内脂质蓄积大量减少。尾静脉注射siRNA沉默P2X7R后，ApoE-/-小鼠血浆中IL-1β水平大幅度降低，AS进展减缓，AS斑块明显减小，斑块内胆固醇晶体及坏死性物质明显减少。进一步机制研究显示，ox-LDL通过上调巨噬细胞内P2X7R诱导蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)磷酸化，促进大量磷酸化PKR与NLRP3形成复合体，最终引起NLRP3炎症小体构型改变并活化[31]。血清凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like ox-LDL scavenger receptor-1,LOX-1)是ox-LDL参与多种炎症性疾病(比如AS)的重要受体。最新研究显示，LPS通过结合巨噬细胞LOX-1诱导细胞内线粒体ROS生成，线粒体DNA ( mitochondrial DNA,mtDNA)损伤，自噬小体形成，进而激活NLRP3炎症小体[32]。综上所述，ox-LDL诱导AS形成可能与NLRP3炎症小体活化相关。
游离脂肪酸(free fat acid,FFA)也能诱导巨噬细胞中炎症小体活化，加剧AS病变进展。研究发现，FFA可直接作用于TLRs，激活NF-κB，促进IL-6、TNF-α等炎症因子表达而发挥促炎作用。棕榈酸(plamitate,PA)是血浆中含量最多的饱和脂肪酸之一。Wen等[33]报道，给予巨噬细胞LPS预处理后，可以诱导细胞内Pro-IL-1β和Pro-IL-18转录易位；PA再处理后即可激活NLRP3炎症小体，浓度依赖性地促进IL-1β和IL-18分泌; Caspase广谱抑制剂zVAD或特异性抑制剂zYVAD均可有效抑制PA引起的IL-1β释放。 单独给予巨噬细胞PA处理，并不能诱导IL-1β表达。另外，NLRP3-/-/ASC-/-/caspase-1-/-小鼠来源的巨噬细胞经PA处理后并不产生IL-1β和IL-18，却能释放TNF-α。AMPK(AMP-activated protein kinase)在FFA代谢中起重要作用。PA与LPS共同作用会激活NLRP3炎症小体，并促进细胞分泌IL-1β，AMPK激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸 (5-aminoimid-azole-4-carboxamide ribonucleoside,AICAR)可以抑制IL-1β释放。究其机制，主要与AMPK通过抑制NOX抑制ROS产生有关[34]。另有研究发现[35]，在单核细胞中，自噬抑制剂或者沉默自噬相关基会诱导产生ROS，进而活化NLRP3炎症小体。同时，在非免疫细胞脂肪酸代谢研究中发现，AMPK通过直接磷酸化自噬相关基因ULK1而上调细胞自噬活性。Wen等[33]认为，PA与LPS共同作用可以抑制AMPK活性，AMPK活性降低后会抑制细胞自噬功能，细胞内ROS水平增加，最终引起NLRP3炎症小体活化。
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一种急性时相反应蛋白，在炎症反应中，SAA水平可以升高1 000倍。血浆中高水平的SAA会增加患心血管疾病的风险。研究发现，人和小鼠AS斑块内均有SAA表达。SAA通过结合巨噬细胞表面TLR2和TLR4,上调人及小鼠巨噬细胞内Pro-IL-1β的表达水平，激活NLRP3炎症小体，诱导IL-1β生成；同时，SAA也可以提高NLRP3 mRNA水平；沉默小鼠巨噬细胞中ASC或NLRP3蛋白后，SAA诱导产生的IL-1β水平明显降低[36]。P2X7R抑制剂KN-62及oATP也能明显降低IL-1β水平[37]。SAA在血中浓度高于100 mg·L-1后细胞内会形成淀粉样蛋白，后者会导致溶酶体结构受损。 Niemi等[36]发现，SAA通过诱导人巨噬细胞释放有活性的组织蛋白酶B活化炎症小体，加重炎症反应，加速AS病变。
高尿酸血症与心血管疾病关系密切。研究发现，单钠尿酸盐(monosodium urate,MSU)结晶通过识别TLRs，激活巨噬细胞中NLRP3炎症小体；髓样分化因子88(MyD88)敲除的骨髓来源巨噬细胞(MyD88-/- BMDMs)经MSU处理后，炎症因子释放减少，浸润的中性粒细胞数量减少。MSU诱导NLRP3炎症小体活化的相关机制可能有：① MSU结晶促细胞内K+外流，激活NLRP3炎症小体[38, 39]。② MSU通过提高巨噬细胞内ROS水平，诱导NLRP3炎症小体活化[40]。③ MSU通过破坏溶酶体结构，促使组织蛋白酶B等促炎蛋白酶释放进入胞质，最终激活NLRP3炎症小体[41]。MSU结晶在加重AS病变及加剧血管炎症反应中发挥重要作用。另外，Usui等[42]发现，磷酸钙(calcium phosphate)结晶也能通过溶酶体-组织蛋白酶B途径激活巨噬细胞中NLRP3炎症小体，诱导caspase-1活化，促使细胞释放大量IL-1β，加速AS病变进展。
3 NLRP3炎症小体与血管平滑肌细胞在AS斑块进展中，动脉中膜的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)迁入内膜，摄取脂质转变为肌源性泡沫细胞，增生迁移形成纤维帽。纤维帽破裂后暴露脂质中心，继发血栓堵塞血管，引起心肌梗死。研究发现，AS全身炎症反应中，VSMCs凋亡诱发的炎症反应约占15%。有报道称，无需巨噬细胞参与，体内功能正常的VSMCs就可有效吞噬凋亡的VSMCs，从而抑制炎症反应，减缓AS斑块进展。Murray等[43]发现，凋亡的VSMCs被邻近正常的VSMCs吞噬后，可以诱导细胞释放大量IL-1β，继而促进血管炎症反应，加重AS病变。
钙盐在AS斑块中沉积会继发动脉钙化。动脉中膜钙化与VSMCs有密切联系。IL-1β及TNF-α等炎症因子在血管钙化的病理生理改变中起关键作用。研究发现，钙盐结晶可激活NLRP3炎症小体。Wen等[44]发现，β-磷酸甘油 (β-glycerophosphate,β-GP)诱导原代大鼠主动脉VSMCs发生钙化后，细胞内NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA水平增加，细胞释放大量IL-1β；沉默NLRP3蛋白后，可降低IL-1β水平，并能抑制VSMCs钙化。同时，人动脉钙化组织中炎症小体相关蛋白的mRNA水平均明显上调，caspase-1活性升高，提示NLRP3炎症小体与动脉炎症及钙化疾病关系密切。
Usui等[42]报道，免疫组化方法检测AS斑块内平滑肌细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)发现，较ApoE-/-小鼠，ApoE-/-/caspase-/-小鼠斑块内VSMCs数量明显减少。Schonbeck等[21]认为，rCD40L可促进人隐静脉VSMCs合成Pro-IL-1β，caspase-1活性增加，释放大量具有生物活性的IL-1β。研究发现[22]，ox-LDL可浓度依赖性促进人主动脉VSMCs表达和释放IL-1β。Sullivan等[45]发现，SAA也可以诱导大鼠主动脉VSMCs中IL-1β基因水平表达。另有报道称[46]，人主动脉VSMCs转染NLRP3 siRNA后再用炎性因子TNF-α处理，可上调NLRP3和IL-1β基因水平；沉默NLRP3蛋白会明显降低IL-1β的表达和释放。
AS是一种慢性血管炎症性疾病，是许多代谢性疾病(糖尿病和肥胖等)的重要死亡原因。多种内源性分子能诱导巨噬细胞和其他类型细胞产生促炎细胞因子，加剧AS炎症反应。IL-1β是人AS斑块内最为常见的促炎细胞因子。ECs、VSMCs及巨噬细胞均可以合成IL-1β。促炎细胞因子可以诱导ECs和巨噬细胞活化，黏附分子表达增加，VSMCs增殖增强，血管通透性提高，加速AS病变发生发展。临床研究发现[19]，缺血性心脏病患者血管中ECs和巨噬细胞均表达IL-1β。
正常生理条件下，IL-1β的生成受到严格调控。IL-1β最初以无活性前体形式Pro-IL-1β存在，经caspase-1剪切后以活化形式IL-1β释放分泌出细胞，发挥促炎作用。普遍认为，IL-1β活化需要两种信号[3]：信号1，诱导细胞内Pro-IL-1β及炎症小体相关蛋白NLRP3合成增加；信号2，诱导炎症小体组装并活化caspase-1，后者剪切Pro-IL-1β生成活化的IL-1β。研究发现[2]，信号1主要与NF-κB活化有关。然而，信号2中炎症小体组装活化的相关机制尚不清楚。普遍认为，炎症小体活化相关机制主要有3种：细胞内ROS水平增加，细胞内K+外流，溶酶体组织蛋白酶活性增加。越来越多的研究显示，单独一种机制不足以诱导其活化[6]。
NLRP3激动剂既可上调细胞内ROS水平，也可促使细胞内K+外流。通过检测caspase-1及IL-1β活性发现，降低ROS水平或者抑制K+外流均能抑制NLRP3激动剂引起的炎症小体活化[5]。有报道称，ROS通过诱导TXNIP与硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)解离，促进TXNIP与NLRP3结合，最终激活NLRP3炎症小体。但是，沉默TXNIP蛋白后并不能完全抑制NLRP3炎症小体活化和IL-1β释放，提示可能存在其他未知NLRP3配体[9]。大量研究显示，炎症小体活化相关的ROS主要来源于线粒体。给予或者不给予ROS激动剂，巨噬细胞内线粒体心磷脂均可直接结合并激活NLRP3炎症小体[47]。mtDNA也被认为可以诱导NLRP3炎症小体活化[48]。
P2X7R是一种ATP门控阳离子选择性通道，被ATP激活后可诱导细胞内K+外流。与其他离子通道不同，P2X7R通道打开后，可允许分子质量>900 u的分子通过。研究认为，P2X7R通道打开会打破细胞内离子平衡[20]，并使半通道蛋白Pannexin-1在细胞膜上形成小孔[3]，胞外配体(如LPS等)得以进入细胞并激活炎症小体，促进IL-1β分泌释放。有报道称，细胞内K+浓度低于90 mmol·L-1 ([K+]<90 mmol·L-1)时，可触发炎症小体组装并募集Pro-caspase-1。因此，细胞内低K+被公认为是诱发NLRP3炎症小体活化的共同机制[39]。另有研究显示，P2X7R诱导PKR磷酸化，促进磷酸化PKR与NLRP3形成复合体，后者可诱导NLRP3炎症小体构型改变并活化[31]。
细胞吞噬颗粒状物质或活的病原体后，引起溶酶体破裂并释放组织蛋白酶，也能激活NLRP3炎症小体，具体分子机制有待进一步研究。钙离子内流及细胞内钙离子浓度增加，也可以激活NLRP3炎症小体[49]。细胞坏死后释放的钙离子可以激活Gαq蛋白偶联受体(GPCR)—钙离子敏感受体(CASR)和GPRC6A。GPCRs活化后激活磷脂酶C(PLC)，PLC剪切二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，生成二酰基甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。IP3结合内质网膜上IP3受体，引起钙离子释放。钙池调控钙离子内流(SOCE)、TRPV2和TRPM2通道介导的钙离子内流也参与NLRP3炎症小体活化。溶酶体破裂释放钙离子也可激活NLRP3炎症小体。有趣的是，并不是所有钙离子相关信号都可以激活NLRP3炎症小体。研究发现，NLRP3炎症小体活化可能与细胞内钙离子浓度及其定位有关。另外，近期有文献指出，在缺乏caspase-1时，caspase-8可作为IL-1β转化酶，与NLRP3炎症小体直接结合促进IL-1β产生[50]。
康纳单抗(canakinumab)，是一种人IL-1β单克隆抗体，目前正在进行康纳单抗抗炎及抗血栓形成的研究(canakinumab anti-inflammatory thrombosis outcomes study,CANTOS)，用以观察其是否可以减少心血管事件[51]。Scrpolioside B是藏药齿叶玄参的一种提取物，被发现可以抑制NF-κB活性，抑制NLRP3炎症小体活化及IL-1β生成[52]。进一步研究发现，Scrpolioside B和梓醇均可以抑制NLRP3和心磷脂合成酶1(CLS1)mRNA及蛋白表达，CLS1被认为与NLRP3炎症小体活化有关[52]。近期，Coll等[53]研究发现，MCC950可作为一种NLRP3抑制剂，特异性阻断NLRP3的活化途径，用于治疗NLRP3相关自身免疫疾病和自身炎症疾病。
综上所述，NLRP3炎症小体以及IL-1β信号与AS病变发生发展密切相关，未来有望成为预防和治疗AS的新的药物靶点。
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