2. 化市第一人民医院检验科,湖南 怀化 418000
2.Dept of Laboratory Medicine,NO.1 Hospital of Huaihuay, Huaihua, Hunan 418000, China
乙二醇(mPEG)修饰的脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met,ENK)半衰期延长、清除率下降、镇痛药效增强[1]。在此基础上,本文对D-Ala替换ENK第2、5位氨基酸([D-Ala2,D-Ala5]-ENK,DADAE)、及其5 ku分子质量mPEG修饰双重结构改造的合成脑啡肽类似物进行了镇痛药效分析。
1 材料与方法 1.1 受试化合物化合物A:ENK-Cys-NH2、化合物B:DADAE-Cys-NH2、化合物C:DADAE-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2为本实验室采用Fmoc固相法合成,RP-HPLC纯化,质量分数大于0.95;MS鉴定:化合物A、B分子质量为677 u和631 u,化合物C在5 662 u附近有一组相差44的峰,与预期相符;生理盐水(NS)溶解,0.45 μm滤膜滤过。吗啡(Mor)为东北第六制药厂生产,批号001009;NS稀释。
1.2 仪器智能热板仪:RB-200型,成都泰盟产品。
1.3 动物分组及给药KM小鼠,♀,体质量18~22 g[中国医学科学院实验动物研究所繁育场,合格证号SCXK(京)2004-0001]。按侧脑室和尾静脉途径,分层随机方法分为NS和Mor对照,及化合物A、B、C试验组,每组10只以上;侧脑室给药[1] 按3.1 μmol·kg-1(0.2 mL·kg-1)、尾静脉给药按31 μmol·kg-1(20 mL·kg-1)条件注射受试及对照药,NS组注射相同体质量容积NS。
1.4 热板镇痛试验[1]20 ℃±1 ℃室温条件,置小鼠于55 ℃±0.5 ℃热板,以接触热板至舔后足所经历时间为痛阈值;剔除痛阈值小于3 s和大于30 s小鼠;观察记录时间点为给药前和给药后15、30、60、120 min。
1.5 数据处理检测数据以±s表示,使用SPSS软件,采用t检验方法比较组间给药前后痛阈值差值数据差异的显著性。
2 结果mPEG5000修饰DADAE侧脑室给药120 min内、尾静脉30 min内痛阈值明显增高表现与对照药吗啡相同,与NS组比较P < 0.05;并且2个途径给药增高痛阈值大于DADAE-Cys-NH2和ENK-Cys-NH2,侧脑室给药时大于吗啡;其中与ENK-Cys-NH2比较,2途径15 min、静脉120 min时P < 0.05,见Tab1,2。
Group | n | Pain threshold/difference with pre-administration/s | ||||
Pre-admin-istration | After 15 min | After 30 min | After 60 min | After 120 min | ||
NS | 12 | 16.74±4.66 | 17.53±8.760.79±8.22 | 18.71±7.381.97±6.72 | 23.68±7.12 6.93±7.01 | 20.56±8.393.82±7.80 |
Mor | 10 | 16.17±4.03 | 51.23±15.5135.07±15.96 ** | 45.02±21.8728.86±22.77 ** | 43.26±16.4027.09±16.37 ** | 32.41±15.4116.09±15.79 * |
ENK-Cys-NH 2 | 9 | 17.02±3.60 | 25.35±13.878.33±15.90 ## | 23.02±6.976.00±7.17 ## | 20.41±8.063.33±7.88 ## | 23.74±9.566.22±10.57 # |
DADAE-Cys-NH 2 | 7 | 13.09±2.78 | 37.36±21.4824.27±20.54 * | 33.68±24.8620.58±23.73 | 30.81±20.4717.72±20.76 | 28.53±18.6515.44±18.08 |
DADAE-PEG | 7 | 16.83±4.84 | 53.46±17.3136.63±16.84 ** | 53.89±16.1237.06±15.71 ** | 52.35±20.2535.51±19.66 ** | 43.36±25.0328.52±21.80 * |
DADAE-Cys-NH 2: [D-Ala 2,D-Ala 5]-ENK, DADAE-PEG: mPEG 5000 modified DADAE-Cys-NH 2. Dose: 3.1 μmol·kg -1, volume: 0.2 ml·kg -1. * P<0.05, ** P<0.01 vs NS; # P<0.05, ## P<0.01 vs DADAE-PEG. |
Group | n | Pain threshold/difference with pre-administration/s | ||||
Pre-admin-istration | After 15 min | After 30 min | After 60 min | After 120 min | ||
NS | 12 | 13.33±4.13 | 12.23±4.71-1.10±6.91 | 15.16±5.811.83±4.56 | 16.94±10.273.62±7.98 | 19.84±13.436.51±10.75 |
Mor | 12 | 15.54±3.99 | 38.15±18.4122.61±17.40 ** | 52.83±12.8837.30±12.30 ** | 29.53±18.8714.00±17.77 | 19.25±6.353.42±6.27 # |
ENK-Cys-NH 2 | 8 | 12.31±4.22 | 18.86±5.546.54±4.09 **# | 18.17±7.575.86±5.17 | 18.94±9.826.63±6.60 | 13.33±6.661.01±5.12 # |
DADAE-Cys-NH 2 | 8 | 14.46±6.42 | 24.24±6.029.77±5.19 ** | 26.80±16.4812.33±13.59 * | 21.87±8.087.40±5.18 | 20.26±14.765.80±12.55 |
DADAE-PEG | 8 | 14.97±4.70 | 37.44±14.9522.47±16.58 ** | 35.08±19.3620.11±21.07 * | 27.55±17.5412.58±18.47 | 36.35±21.0021.38±20.31 |
Dose: 31 μmol·kg -1, volume: 20 mL·kg -1. |
已知ENK序列中Tyr和3位Gly、4位Phe为活性必需残基[2],采用非天然结构的D型氨基酸替换非必须氨基酸可提高ENK酶解稳定性,并且适宜分子质量聚乙二醇修饰有利于稳定ENK结构、改善其通过血脑屏障的能力[3, 4]。参考以上原则,本文合成ENK类似物 [D-Ala2,D-Ala5]-ENK(DADAE),采用Cys巯基修饰方法对合成产物进行5ku分子质量mPEG的C端定点修饰[5],并以测试中枢镇痛药效的小鼠热板致痛模型[6]进行活性分析。实验结果,合成产物镇痛活性和维持时间的表现是:mPEG5000修饰DADAE>DADAE>ENK,并且mPEG5000修饰DADAE镇痛作用有优于等剂量吗啡的趋势。本文实验结果与Arizona大学的类似研究结论[3, 4]一致,对改善ENK及其类似物的成药性具有积极意义(侧脑室NS、Mor、ENK-Cys-NH2组数据已见参考文献1,本文因同批次试验数据分析需要列出)。
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