2.山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室， 山东 济南 250355
2.Key Laboratory for Classical Theory of Traditional Chinese Medicine of Education Ministry， Shangdong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China
经前期综合征肝气郁证(premenstrual syndrome，PMS)症状表现类似于现代医学中的抑郁样情绪改变，前期研究证明PMS肝气郁证的发生与脑内5-HT系统及其受体密切相关[1]，柴胡提取物通过不同分子机制干预PMS肝气郁证的抑郁情绪[2, 3]。但是柴胡提取物在5-HT3R水平对PMS肝气郁证经前抑郁情绪的干预机制尚未见报道，因此，本实验选取PMS肝气郁证为动物模型初步探讨柴胡提取物调控抑郁情绪的微观作用机制。
1 材料 1.1 实验动物Wistar大鼠，体质量(180～200)g，♀，由山东中医药大学动物中心提供,实验动物许可证号: SCXK(鲁)2011-0003。
1.2 药品与主要试剂柴胡提取物(青岛阳光海川医药科技发展有限公司生产，批号:20110526); Anti-5-HT3A receptor antibody (ab51950),Anti-HTR3B (MFG40388)，5-HT3A 二抗(Abcam，ab-16248)，5-HT3B二抗(sc-2020)。
2 方法 2.1 PMS 肝气郁证大鼠模型制备及取材根据文献方法选取大鼠(随机分为3组，每组12只)并复制PMS肝气郁证模型[3]，连续造模5 d，治疗组大鼠造模同时灌胃柴胡提取物(0.32 g·kg-1)，正常对照组和模型组各给予相同体积的生理盐水。将每组6 只大鼠用多聚甲醛心脏灌流，取前额叶，石蜡包被，切片，用于免疫荧光实验。每组另外6只大鼠，于冰块上剥离额叶，放于-80℃冰箱，Western blot实验备用。
2.2 免疫荧光双标记法检测大鼠额叶5-HT3A/3BR分布石蜡切片常规脱蜡，抗原热修复，封闭，结合一抗(1: 400)，复温、洗涤，结合二抗(1: 500)，洗涤，滴加甘油，封片。置激光共聚焦显微镜下观察5-HT3AR、5-HT3BR在额叶的分布及同位点表达情况。
2.3 Western blot方法检测大鼠额叶5-HT3A/3BR蛋白表达以 50μg 额叶总蛋白每泳道上样，电泳分离，转膜，封闭。与一抗(anti-5-HT3B 1: 400，anti-5-HT3A 1: 400)和β-actin1: 400，anti-5-HT3B 1: 400)孵育，洗涤，用ECL化学发光试剂检测杂交信号。(1: 1 500)抗体孵育，洗涤，结合各自相应二抗(anti-5-HT3A
2.4 统计学方法实验数据用Graphpad Prism 5.0 统计软件进行单因变量多因素方差分析。
3 结果 3.1 各组大鼠额叶5-HT3A/3BR的定位分布各组大鼠额叶5-HT3AR和5-HT3BR阳性细胞共表达呈黄色，细胞核为蓝色荧光，额区阳性细胞均有分布，且多分布于细胞膜，细胞形态多为点状或圆状。
3.2 各组大鼠额叶5-HT3AR蛋白表达与正常组相比，模型组额叶5-HT3AR蛋白表达明显升高(P < 0.05)；与模型组相比，柴胡提取物组5-HT3AR蛋白表达明显降低(P < 0.05)。
3.3 各组大鼠额叶5-HT3BR蛋白表达与正常组相比，模型组额叶5-HT3BR蛋白表达明显升高(P < 0.05)；与模型组相比，柴胡提取物组5-HT3BR蛋白表达降低(P < 0.05)。
4 讨论文献报道5-HT3AR和5-HT3BR为5-HT3R最主要的两个受体亚型，且5-HT3AR为5-HT3 R离子通道的功能性受体[4]，因此，本实验以大鼠额叶5-HT3A和5-HT3BR作为研究对象。结果发现，PMS肝气郁证模型组大鼠额叶5-HT3AR和5-HT3BR蛋白表达均明显升高，柴胡提取物干预后其蛋白表达明显降低，由此推测PMS肝气郁证模型抑郁情绪的发生可能与 5-HT3AR和5-HT3BR 蛋白上调有关，柴胡提取物通过下调额叶5-HT3AR、5-HT3BR蛋白表达发挥其抗抑郁样情绪的作用。在下一步的工作中需要继续寻找柴胡发挥其抗抑郁样作用与5-HT3R信号转导通道的关系，以期望更进一步探索PMS的发病机制及柴胡提取物干预PMS肝气郁证经前抑郁情绪的药理作用机制。
(致谢：本文实验在山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室完成，在此深表感谢！)
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