2.武警后勤学院附属医院,天津 300162;
3.武警总医院，北京 100039； 4.武警后勤学院,天津 300309
2.Affiliated Hospital of Logistics University of CAPF, Tianjin 300162, China;
3.General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039,China;
4.Logistics University of CAPF, Tianjin 300309, China
以往单一靶点的抗肿瘤药物极易产生耐药[1, 2, 3]。多靶点的化疗药物具有其独特优势，如多靶点的化疗药物是单分子化合物，不存在多药物联合应用中的药物相互作用问题，也可避免药物联合应用中药物配伍、剂量、给药方式等问题。本课题组以天然产物中鬼臼毒素为母核，整合了具有抗肿瘤耐药的小分子片段，将鬼臼毒素新衍生物设计为同时作用于多个耐药靶点的化合物，以更好的克服传统单靶点化疗药物易产生多药耐药的缺陷。前期筛选发现衍生物CCP-1具有良好的抗肿瘤多药耐药的作用。本文将对CCP-1的体内和体外抗肿瘤作用及其可能作用机制作初步探讨。
1 材料与方法 1.1 一般材料CCP-1，分子质量614.6。依托泊苷(etoposide,VP-16)，分子质量588.56。人口腔鳞癌细胞KB及其长春新碱耐药细胞株KBv200，人慢性髓性白血病急变期细胞K562及其阿霉素耐药株K562/A02培养于RPMI 1640培养基中。♂昆明种小鼠，体质量18~22 g，SPF级。动物移植性肿瘤S180肉瘤由天津药物研究院传代保种。
1.2 方法 1.2.1 MTT法测定CCP-1对多药耐药细胞的抗肿瘤活性按照文献[4]方法进行测定。
1.2.2 流式细胞仪检测CCP-1对KBv200细胞凋亡率的影响加入CCP-1(1.0、2.0、4.0 μmol·L-1)，进行流式细胞仪检测。
1.2.3 CCP-1对耐药相关基因mdr-1表达的影响加入CCP-1(1.0、2.0、4.0 μmol·L-1)处理细胞。PCR分析：β-actin作为内标，靶基因为mdr-1。
1.2.4 免疫细胞化学法观察CCP-1对KBv200细胞P-gp蛋白表达的影响[5]加入CCP-1(1.0、2.0、4.0 μmol·L-1),滴加兔抗人多克隆抗体(稀释比例为1 ∶200)、鼠抗兔IgG二抗。光镜观察并照相。
1.2.5 免疫荧光法检测CCP-1对KBv200细胞微管蛋白的影响给药组加入等浓度的CCP-1、长春新碱和紫杉醇，滴加兔抗人多克隆抗体、FITC标记的鼠抗兔IgG二抗、DAPI染液，高内涵成像系统检测并拍照。
1.2.6 动物移植肿瘤模型研究CCP-1体内抗肿瘤作用按照文献[6]方法进行测定。
1.2.7 统计学分析采用SPSS17.0统计软件包处理分析数据，数据用x±s表示，采用单因素方差分析(One-way ANOA)，显著性水准为0.05。
2 结果 2.1 MTT法测定CCP-1对体外培养细胞增殖的影响从Tab 1、2可以看出CCP-1对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤作用(IC50: 1.41~3.34 μmol·L-1)，与VP-16相比CCP-1显示了更强的抗肿瘤活性，且对多药耐药细胞株的杀伤作用明显高于临床上广泛使用的VP-16。
| IC 50/μmol·L -1 | |||
| KB | KBv200 | Mult of Drug fast | |
| Vincristine | 0.28±0.07 | 9.25±1.03 | 33.04 |
| Etoposide | 1.71±0.04 | 12.1±1.23 | 7.07 ** |
| CCP-1 | 1.41±0.06 | 2.06±0.38 ** | 1.46 ** |
| ** P<0.01 vs control | |||
| IC 50/μmol·L -1 | |||
| K562 | K562/A02 | Mult of Drug fast | |
| ADM | 0.34±0.11 | 12.22±1.25 | 35.94 |
| Etoposide | 3.56±0.23 | 34.76±4.23 | 9.76 ** |
| CCP-1 | 1.02±0.58 | 3.34±1.12 ** | 3.27 ** |
| ** P<0.01 vs control | |||
| Group | Body weight/g | Tumor weight/g | Inhibition/% |
| Control | 23.81±2.39 | 1.254±0.09 | - |
| CCP-1(25 mg·kg -1·d -1) | 21.83±1.64 | 0.563±0.06 ** | 55.11 |
| CCP-1(50 mg·kg -1·d -1) | 21.52±3.43 | 0.467±0.05 ** | 62.72 |
| Etoposide(20 mg·kg -1) | 15.88±1.71 ** | 0.52±0.02 ** | 58.54 |
| ** P<0.01 vs control | |||
CCP-1(1.0~4.0 μmol·L-1)可诱导KBv200细胞产生凋亡，且有明显量效关系。
2.3 CCP-1对mdr-1基因mRNA表达的影响 本研究发现CCP-1随给药浓度的增加可使mdr-1的mRNA表达量减少，有较明显的剂量依赖性。
2.4 免疫细胞化学法观察CCP-1对KBv200细胞P-gp蛋白表达的影响实验结果显示，随剂量的增加，CCP-1有降低P-gp蛋白表达的明显趋势。
2.5 免疫荧光法检测CCP-1对KBv200细胞微管蛋白的影响实验显示长春新碱能够阻止微管结构的合成，而CCP-1作用于KBv200细胞6 h 后，与紫杉醇作用结果相似，能够促进微管聚合、抑制微管解聚。
2.6 CCP-1对小鼠实体型S180肉瘤的抑制作用腹腔注射CCP-1(25、50 mg·kg-1·d-1)，对小鼠实体型S180肉瘤的生长抑制率分别为55.11%和62.72%。在小鼠体重方面，高低剂量组与阴性对照组相比较未见明显减轻(P>0.05)。阳性对照组依托泊苷(20 mg·kg-1·d-1)抑瘤率为58.54%，但小鼠体重与阴性对照组相比有明显降低(体重下降20%)，且出现动物死亡现象(死亡4只)。
3 讨论本实验室通过结构改造和构效关系的研究，引入活性基团，合成了一系列结构新颖的鬼臼毒素衍生物，其中CCP-1是将小分子5-甲氧基吲哚引入天然产物鬼臼毒素中合成的全新化合物，4β-(5-甲氧基吲哚3-草酰氨基)-4-脱氧表鬼臼毒素(Fig 1)，具有微管蛋白的抑制剂活性。
|
| Fig 1 Chemical structure of CCP-1 |
本实验中，MTT法结果显示CCP-1对多种肿瘤细胞敏感，与抗癌药物依托泊苷相比，其抗肿瘤活性更强，显示了其高效低毒，抗癌谱广等优点，并对耐药细胞也有明显的抑制活性。本研究通过流式细胞术观察发现CCP-1可使细胞出现明显凋亡现象，由此推断CCP-1可能通过凋亡途径来发挥抗肿瘤作用。经典的MDR主要与一种相对分子质量为170 ku的跨膜糖蛋白(P-gp)有关[7-8]。分子水平研究显示：CCP-1可使KBv200细胞中mdr-1基因mRNA水平下降，免疫细胞化学法显示了相同的作用，不同浓度的CCP-1均可使KBv200细胞P-gp蛋白的表达量降低。由此提示CCP-1诱导多药耐药细胞凋亡，可能通过降低p-gp高表达细胞株上p-gp的表达，从而增加多药耐药细胞对抗癌药物的敏感性。含有微管蛋白的结构，如微管等，对有丝分裂过程中纺锤体的形成非常重要，在细胞生长、分裂以及细胞骨架组成中扮演关键角色。免疫荧光法检测显示CCP-1能够促进微管聚合、抑制微管解聚，这可能是其引起细胞凋亡的一个重要原因。动物移植肿瘤模型试验发现，CCP-1对小鼠实体肉瘤S180的生长抑制作用强于VP-16且毒性更小。
综上所述，CCP-1抗肿瘤多药耐药作用机制可以归结为下调 mdr-1基因的表达，从而减少P-gp蛋白表达量，逆转其多药耐药表型，同时作用于微管蛋白促进微管聚合，进而诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡。CCP-1较本实验室先前合成的鬼臼毒素衍生物YB-L1EPO、YB-1EPN等有更强的抗肿瘤活性及抗多药耐药性，且毒性更小，有望成为新型高效的多靶点抗肿瘤药物。
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