2. 山东省中西医结合医院药学部, 山东 济南 250001;
3. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250355
2. Dept of Pharmacy, Shandong Provincial Hospital of Integrated Medicine, Jinan 250001, China;
3. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China
高架〇迷宫实验(elevated zero maze，EZM)是评价状态焦虑动物模型的经典方法之一，广泛应用于精神神经药理学基础研究；EZM源于高架十字迷宫实验(elevated plus maze，EPM)，两者原理都是基于实验动物探索习性与危险环境之间的矛盾冲突。EZM作为焦虑动物模型进行药理学评价时，常受实验环境、实验操作及实验动物种属、品系、性别等诸多因素影响而导致结果不尽一致[1, 2, 3]；本研究采用组内相关系数(intraclass correlation coefficient，ICC)和kappa一致性系数(kappa agreement index，κ)[4]，初步探讨EZM作为昆明小鼠状态焦虑动物模型的重测信度，筛选出稳定参数，并进行行为模式分析。
1 材料与方法 1.1 实验动物昆明小鼠，♂/♀，由山东大学实验动物中心提供，许可证号SYXK(鲁)20130001；室温(20±2)℃，光照12 h(18:00～6:00)和黑暗12 h(6:00～18:00)环境，自由进水饮食饲养；预适应环境1 周后，选取体质量(20±2)g小鼠进入正式实验(所有实验均于6:00～18:00进行)。
1.2 实验装置木质〇迷宫(65 cm×5 cm)，包括2部分：两相对开臂区(30 cm×5 cm)，两相对闭臂区，附有立墙(30 cm×5 cm×30 cm)；〇迷宫离地面50 cm，实验由25 W红灯泡离圆心40 cm高处照明[5]。
1.3 实验操作操作者将小鼠放入高架〇迷宫任一开臂区中间，头面对圆心，用摄像系统记录动物5 min的行为变化，包括两臂区进入时间及进入次数；其中，小鼠4只爪子由一臂区均进入另一臂区方可开始记录实验参数。每只动物实验结束后清除粪便，用70%乙醇喷洒箱底并用洁净纱布抹干，以免前一只动物的残留气味造成对本次实验的影响；全部实验结束后由不熟悉实验设计人员进行数据提取录入。EZM纳入实验参数有：开臂区进入时间百分率(Otime%)、开臂区进入时间(Otime)、闭臂区进入时间(Ctime)、开臂区进入次数百分率(Oentries%)、开臂区进入次数(Oentries)、闭臂区进入次数(Centries)及两臂区进入总次数(Entries)；其中实验参数Otime%、Entries数据又进行分割细化处理，按照5个重复测量片段(1 min)来进行提取。
1.4 统计学分析采用SPSS 13.0 for Windows软件进行统计分析，GraphPad Prism 6.0软件进行统计作图。重测信度采用ICC 和κ统计参数来评价，其中ICC参数主要适用于连续变量或等级变量，由Analyze→Scale→Reliability Analysis程序完成；κ参数主要适用于分类变量，由Analyze→Descriptive statistics→Crosstabs程序完成，分析前首先根据1st分位数、3rd分位数进行低(Low≤1st分位数)、中(1st分位数＜Medium＜3rd分位数)、高(High≥3rd分位数)状态分类；ICC/κ：>0.75认为一致性很好，0.50～0.75认为一致性一般，< 0.50则认为一致性较差。此外，EZM实验参数Otime%、Entries所有数据先进行Kolmogorov-Smirnov正态分布检验，而后依据其结果，总体数据进行t检验，而重复测量数据则进行Wilcoxon检验和Friedman检验[4, 6, 7, 8, 9]。
2 结果 2.1 EZM重测信度检验ICC参数提示，Otime%(♂ ICC=0.753，P < 0.01；♂+♀ ICC=0.535，P < 0.05)、Otime(♂ ICC=0.753，P < 0.01；♂+♀ ICC=0.535，P < 0.05)、Ctime(♂ ICC=0.753，P < 0.01；♂+♀ ICC=0.535，P < 0.05)、Oentries(♂ ICC=0.719，P < 0.01；♀ ICC=0.494，P < 0.05；♂+♀ ICC=0.583，P < 0.01)、Centries(♀ ICC=0.658，P < 0.01；♀ ICC=0.508，P < 0.05；♂+♀ ICC=0.562，P < 0.01)、Entries(♂ ICC=0.691，P < 0.01；♀ ICC=0.502，P < 0.05；♂+♀ ICC=0.574，P < 0.01)初测重测信度较好，且有统计学意义。见Tab 1，Fig 1、2。κ参数提示，Otime%(♂ κ=0.393，P < 0.05)、Ctime(♂ κ=0.393，P < 0.05)、Oentries(♂ κ=0.308，P < 0.05；♂+♀ κ=0.256，P < 0.05)、Centries(♂ κ=0.427，P < 0.01；♂+♀ κ=0.238，P < 0.05)、Entries(♂ κ=0.469，P < 0.01)有统计学意义，但初测重测信度相对较差。见Tab2、3、4。
| Parameters | Test | Retest | ICC a | ||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | ♂ | ♀ | ♂+♀ | ♂ | ♀ | ♂+♀ | |
| Otime% | 15.35±9.54 | 14.38±7.63 | 14.82±8.46 | 14.61±7.88 | 10.91±9.36 | 12.57±8.83 | 0.753 ** | 0.273 | 0.535 * |
| Otime | 46.05±28.61 | 43.15±22.92 | 44.45±25.39 | 43.82±23.63 | 32.74±28.08 | 37.71±26.50 | 0.753 ** | 0.273 | 0.535 * |
| Ctime | 253.95±28.61 | 256.85±22.92 | 255.55±25.39 | 256.18±23.63 | 267.26±28.08 | 262.29±26.50 | 0.753 ** | 0.273 | 0.535 * |
| Oentries% | 46.65±4.52 | 43.87±9.67 | 45.11±7.85 | 49.15±3.67 | 38.42±17.25 | 43.24±14.01 | 0.005 | -0.139 | 0.010 |
| Oentries | 9.04±7.05 | 8.89±6.65 | 8.96±6.76 | 9.82±5.28 | 7.44±7.62 | 8.51±6.72 | 0.719 ** | 0.494 * | 0.583 ** |
| Centries | 9.73±7.17 | 9.92±6.84 | 9.83±6.92 | 10.09±5.14 | 8.33±7.69 | 9.12±6.66 | 0.658 ** | 0.508 * | 0.562 ** |
| Entries | 18.77±14.21 | 18.81±13.47 | 18.80±13.66 | 19.91±10.36 | 15.78±15.31 | 17.63±13.35 | 0.691 ** | 0.502 * | 0.574 ** |
| a * P<0.05; ** P<0.01 | |||||||||
| Parameters | Test | Retest | κ a | ||||||||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | ♂ | ♀ | ♂+♀ | ♂ | ♀ | ♂+♀ | |||||||
| 1 st | 3 rd | 1 st | 3 rd | 1 st | 3 rd | 1 st | 3 rd | 1 st | 3 rd | 1 st | 3 rd | ||||
| Otime% | 7.00 | 22.92 | 7.00 | 19.67 | 7.17 | 21.83 | 9.75 | 19.83 | 4.67 | 15.00 | 5.50 | 16.17 | 0.393 * | -0.096 | 0.078 |
| Otime | 21.00 | 68.75 | 21.00 | 59.00 | 21.50 | 65.50 | 29.25 | 59.50 | 14.00 | 45.00 | 16.50 | 48.50 | 0.200 | -0.096 | 0.078 |
| Ctime | 231.25 | 279.00 | 241.00 | 279.00 | 234.50 | 278.50 | 240.50 | 270.75 | 255.00 | 286.00 | 251.50 | 283.50 | 0.393 * | -0.050 | 0.078 |
| Oentries% | 44.44 | 50.00 | 42.86 | 48.15 | 42.86 | 49.53 | 46.15 | 50.78 | 33.33 | 48.39 | 44.44 | 50.00 | 0.038 | 0.032 | 0.068 |
| Oentries | 3.00 | 14.50 | 3.00 | 12.00 | 3.00 | 12.50 | 6.00 | 14.00 | 1.00 | 13.00 | 3.50 | 13.50 | 0.308 * | 0.146 | 0.256 * |
| Centries | 3.75 | 16.00 | 4.00 | 14.00 | 4.00 | 14.00 | 6.75 | 14.00 | 2.00 | 13.00 | 4.00 | 14.00 | 0.427 ** | 0.250 | 0.238 * |
| Entries | 6.75 | 30.50 | 7.00 | 26.00 | 7.00 | 26.50 | 12.75 | 28.25 | 3.00 | 26.00 | 7.50 | 27.50 | 0.469 ** | 0.250 | 0.191 |
| a * P<0.05, ** P<0.01. | |||||||||||||||
|
| Fig 1 Correlation between Test and Retest of elevated zero maze for the “Otime%” parameter ♂ ICC=0.753, ♀ ICC=0.273, ♂+♀ ICC=0.535. |
|
| Fig 2 Correlation between Test and Retest of elevated zero maze for the “Entries” parameter ♂ ICC=0.691, ♀ ICC=0.502, ♂+♀ ICC=0.574. |
| Test | Retest | ||||||||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | |||||||||||
| Low | Medium | High | Total | Low | Medium | High | Total | Low | Medium | High | Total | ||
| ♂ | Low | 2 | 3 | 0 | 5 | ||||||||
| Medium | 3 | 8 | 1 | 12 | |||||||||
| High | 0 | 1 | 4 | 5 | |||||||||
| Total | 5 | 12 | 5 | 22 | |||||||||
| ♀ | Low | 3 | 3 | 2 | 8 | ||||||||
| Medium | 2 | 8 | 2 | 12 | |||||||||
| High | 2 | 2 | 3 | 7 | |||||||||
| Total | 7 | 13 | 7 | 27 | |||||||||
| ♂+♀ | Low | 2 | 9 | 1 | 12 | ||||||||
| Medium | 9 | 12 | 4 | 25 | |||||||||
| High | 1 | 4 | 7 | 12 | |||||||||
| Total | 12 | 25 | 13 | 49 | |||||||||
| ♂κ=-0.393, ♀κ=-0.096, ♂+♀κ=0.078. | |||||||||||||
| Test | Retest | ||||||||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | |||||||||||
| Low | Medium | High | Total | Low | Medium | High | Total | Low | Medium | High | Total | ||
| Low | 2 | 3 | 0 | 5 | |||||||||
| ♂ | Medium | 2 | 9 | 1 | 12 | ||||||||
| High | 1 | 0 | 4 | 5 | |||||||||
| Total | 5 | 12 | 5 | 22 | |||||||||
| Low | 5 | 4 | 1 | 10 | |||||||||
| ♀ | Medium | 2 | 7 | 2 | 11 | ||||||||
| High | 1 | 2 | 3 | 6 | |||||||||
| Total | 8 | 13 | 6 | 27 | |||||||||
| Low | 4 | 9 | 1 | 14 | |||||||||
| ♂+♀ | Medium | 6 | 13 | 4 | 23 | ||||||||
| High | 2 | 3 | 7 | 12 | |||||||||
| Total | 12 | 25 | 12 | 49 | |||||||||
| ♂κ=0.469, ♀κ=0.250, ♂+♀κ=0.191. | |||||||||||||
Kolmogorov-Smirnov检验提示，Otime%、Entries总体数据符合正态分布，而重复测量数据则仅部分符合正态分布(P>0.05)。t检验结果提示，与初测相比，重测EZM实验参数Otime%(♂ t=0.447，♀ t=1.626，♂+♀ t=1.612，P>0.05)、Entries(♂ t=-0.441，♀ t=0.949，♂+♀ t=0.551，P>0.05)差异无统计学意义。Wilcoxon检验结果提示(Fig3)，与初测相比，重测EZM实验参数Otime%在第2nd min(♀ z=-3.37，P < 0.01；♂+♀ z=-2.70，P < 0.01)均降低且差异有统计学意义，而Entries亦在第2nd min(♀ z=-2.74，P < 0.01)降低且差异有统计学意义。Friedman检验结果提示，初测EZM实验参数Otime%(♂ χ2=16.63，P < 0.01；♀ χ2=11.22，P < 0.05；♂+♀ χ2=26.88，P < 0.01)、Entries(♀ χ2=22.29，P < 0.01；♂+♀ χ2=21.77，P < 0.05)及重测EZM实验参数Otime%(♂ χ2=13.58，P < 0.01；♀ χ2=31.38，P < 0.01；♂+♀ χ2=41.91，P < 0.01)、Entries(♂ χ2=13.52，P < 0.01；♂+♀ χ2=16.53，P < 0.01)重复测量片段间差异均有统计学意义。
|
| Fig 3 Behavioral pattern of elevated zero maze for the “Otime%”(ABC) & “Entries”(DEF) parameters during a 5-minute observation period *P < 0.05, **P < 0.01 vs test |
EZM是Shepherd等[10]于1992年最先提出，其原理亦是基于实验动物探索习性与危险环境之间矛盾冲突，是一种相当于EPM变型的新型焦虑动物模型；但是EZM又不同于EPM[10, 11]：①没有中央区，不存在中央“死时间”；②实验动物探索行为是连续的，不受到两臂区末端影响；③两臂区之间可以直接转换，不需要经过中央区过渡，而EZM同时也存在这样一个问题：即两臂区进入次数通常相等或者仅差1，导致两臂区进入次数百分率实验参数失去评价意义。
Shepherd等[12]研究发现，抗焦虑药物可明显增加SD大鼠EZM开臂区进入时间百分率和开臂区低头探索频次，减少由闭臂区向开臂区伸躯探索频次，而致焦虑药物则产生相反效应；同时一定剂量范围抗抑郁药物5-HT1A受体激动剂(0.001~0.1 mg·kg-1 8-OH-DPAT)可减少由闭臂区向开臂区伸躯探索频次，5-HT3A受体拮抗剂(0.0001~1.0 mg·kg-1昂丹司琼)可增加开臂区进入时间百分率，减少由闭臂区向开臂区伸躯探索频次。Cook等[13]研究比较了3个不同远交品系和2个不同杂交品系小鼠对EZM重复测量效应的差异，发现不同品系是通过不同感官(视觉、嗅觉等)来收集EZM初始位置，以避免进入EZM开臂区危险域。Milner等[14]研究比较了15个不同近交品系小鼠焦虑动物模型行为模式，发现EZM及旷场实验、明暗箱实验中反映焦虑情绪相关行为参数与反映运动探索相关行为参数无法区分，而与反映紧张情绪粪便粒数参数可以加以区分。Kulkarni等[15]研究不同类别抗焦虑药物，包括安定类、巴比妥类、乙醇、印防己毒素(通道阻滞剂)、戊四唑、氟马西尼(BDZRs拮抗剂)等，发现EZM对以苯二氮卓类受体(BDZRs)-γ-氨基丁酸A受体(GABAAR)-氯离子通道复合物为作用靶点的工具药物均有效。
本研究ICC和κ结果均提示，EZM实验参数重测信度受性别影响较大，♂昆明小鼠EZM重测信度相对较好(尤其是Otime%和Entries)，而♀昆明小鼠EZM重测信度相对较差；Wilcoxon检验结果也显示仅♀昆明小鼠EZM实验参数Otime%、Entries在初测重测第2nd min均有显著性差异。此外，尽管Friedman检验结果显示♂/♀昆明小鼠EZM实验参数Otime%、Entries在5个重复实验片段中具有波动性，但是t检验结果仍然证实，♂/♀昆明小鼠EZM实验参数Otime%、Entries受重复测量效应影响相对较小。因此，EZM作为昆明小鼠状态焦虑动物模型进行评价时，推荐采用Otime%、Entries实验参数，推荐采用♂实验动物，而间隔1周重复测量效应可以忽略。动物模型是研究疾病发生机制和评价药物效应的有力工具；动物模型行为具有多维性，是结构和功能共同相互作用的结果；有关EZM状态焦虑动物模型相关研究将在后续研究陆续报道。
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