DNA甲基化反应是由DNA甲基转移酶(DNMT)催化的，目前发现的DNMTs家族包括：DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B以及DNMT3L，其中DNMT1是一种持续性DNA甲基转移酶，维持有丝分裂期DNA的甲基化状态^{[1, 2]}。DNA甲基化不仅参与基因表达调控,而且参与肿瘤的发生发展过程，是肿瘤常见表观遗传学改变之一^[3]，DNMT成为一个重要的分子靶标，在疾病的治疗和预防中发挥重要作用^[4]。有实验证明,在急性白血病患者和白血病细胞株中,DNMT基因异常高表达^[5]。这些高表达的DNMT可能诱导某些相关基因，尤其是一些抑癌基因异常甲基化，最终可能导致白血病发生。因此，通过靶向性沉默DNMT1基因，重新启动基因转录，阻滞细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。

目前去甲基化治疗已成为肿瘤诱导分化、抑制增殖的新方法，为探讨靶向沉默DNMT1对急性淋巴细胞白血病的作用，本研究通过人工化学合成针对DNMT1基因的siRNA片段，以Lipofectamine^TM 2000为介导，靶向沉默Molt-4细胞DNMT1基因的表达，探讨其对Molt-4细胞增殖、凋亡以及对组蛋白调控的影响，研究白血病靶向基因治疗。

细胞培养箱(3111，美国Thermo公司)，低温离心机(J2-21型 Beckman公司)，常温离心机(上海医疗器械公司)，倒置显微镜(Model-U-LH 100HG，日本OLYMPUS产品)，全自动凝胶成像系统(GeneGenius，英国Syngene公司)，UV2100紫外分光光度仪(上海谱析公司)，PCR扩增仪(AG22331，德国Eppendorf公司)，迷你垂直电泳槽(美国BIO-RAD公司)，脱色摇床(北京东方仪器厂)。

RPMI 1640培养基(美国 Gibco公司)；Lipofectamine^TM2000 转染试剂、RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒及Opti-MEM试剂(美国Invitrogen公司)；DNMT1 siRNA及PCR引物(上海吉玛制药技术有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；二甲基亚砜及MTT(浓度为5 g·L^-1)(美国Sigma公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo公司)；β-actin、DNMT1、procaspase-3、BCL-2、P15单克隆抗体及Goat anti-mouse with HRP conjugate、 Goat anti-rabbit with HRP conjugate 二抗(美国Santa Cruz公司)；Anti-acetyl-Histone H3、Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys9)、Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)(美国Upstate 公司)。

取人类急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞株(中国科学院上海细胞库)，培养于含 15%胎牛血清、青霉素100 kU·L^-1+链霉素100 kU·L^-1的 RPMI 1640 培养液，置于 37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱培养，每2～3天传代 1 次，选择对数生长期细胞进行实验。

依据Reynolds等总结的设计siRNA 原则，针对DNMT1区域选择作用靶点的小干扰RNA片段，委托上海吉玛公司合成。DNMT1 siRNA序列Sense 5′-GCACCU CAUUUGCCGAAUATT-3′,Antisense5′-UAUUCGGCA AAUGAGGUGCTT -3′，同时合成标有荧光标记的通用随机阴性序列作为对照。转染前取对数生长期Molt-4细胞，悬浮于无抗生素的培养液中，调整细胞浓度为(8～16)×10⁵。以Lipofectamine^TM 2000为载体进行转染，步骤参照说明书。

选择对数生长期的Molt-4细胞，接种在6孔板上，DNMT1 siRNA浓度分别为0、30、60、120 nmol·L^-1，每孔总体积为2 mL。转染后培养24 h，TRIzol法提取总RNA，经紫外分光光度法鉴定定量，A₂₆₀/A₂₈₀比值均在1.8～2.0之间，经逆转录为cDNA。以反应制备所得的cDNA进行PCR扩增。设计PCR引物序列如下：DNMT1上游引物：5′-AGGTTGATGTCTGCGTGGTAGC-3′，下游引物5′-CCGAGTTGGTGATGGTGTGTAC-3′；β-actin上游引物：5′- CAGGAGGAGCAATGATCTTGATCT-3′，下游引物5′- TCATGAAGTGTGACGTGGACATC-3′。PCR反应条件：95℃ 5 min预变性，95℃ 45 s变性，49℃ 45 s退火，72℃ 45 s延伸，40个循环，72℃ 10 min再延伸。最后将PCR产物经16 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳，于凝胶图像分析仪上自动分析成像。

将对数生长期的Molt-4细胞接种于96孔培养板中，2×10⁴个/孔，DNMT1 siRNA浓度分别为0、30、60、120 nmol·L^-1。终体积为200 μL，每组设6个平行孔。细胞转染后置于37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中继续培养24、48和72 h，于实验结束前4 h取出一块板，加5 g·L^-1 MTT 20 μL，继续培养4 h，离心，吸去上清，加入二甲基亚砜150 μL，震荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪单波长492 nm 测吸光度(A 值)，计算细胞增殖率。细胞增殖率/%=(A实验-A空白) / (A对照-A空白)×100%。实验重复 3 次。以时间为横坐标，细胞增殖率为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

将Molt-4细胞悬液接种于6孔板上，终体积为2 mL，DNMT1 siRNA浓度分别为0、30、60、120 nmol·L^-1，转染后培养24 h，离心收集细胞。依据BD公司Annexin V和PI双染试剂盒说明书进行处理，应用流式细胞仪检测。

DNMT1 siRNA转染24h后，收集上述各处理组细胞，预冷的PBS洗涤2次后，按照 1×10⁶ 细胞加入100 μL 裂解液和1 μL 酶抑制剂的比例充分裂解细胞。于低温(4℃)下，12 000 r·min^-1离心15 min后，收集蛋白，-20℃保存备用。BCA法进行蛋白定量，取备用蛋白，以12%SDS-PAGE电泳分离后，电转移法转膜，室温下水平摇床上缓慢摇动，封闭1 h；放入TBS 1 ∶400稀释的一抗中，4℃过夜。TBS洗涤液洗膜3次后，分别放入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下水平摇床上缓慢摇动1 h；洗膜后化学发光法显色，X射线胶片扫描后，以β-actin为内参，应用AlphaDigiDoc图像分析软件分析比较。

应用SPSS 17.0软件处理。计量资料数据以x± s 表示。单变量两组资料比较采用t检验，多组资料比较采用单因素方差分析。

DNMT1 siRNA转染Molt-4细胞24 h后，提取mRNA进行RT-PCR，与对照组比较可见，DNMT1 siRNA组的mRNA条带亮度明显减弱，而且随着DNMT1 siRNA浓度的增加，亮度呈递减趋势，其中120 nmol·L^-1组亮度减弱最明显，表现出浓度依赖性(Fig 1)。0、30、60、120 nmol·L^-1组DNMT1扩增条带灰度值与β-actin 比值分别为：0.99±0.18、0.85±0.15、0.20±0.07和0.09±0.01，与对照组相比，各处理组差异均有统计学意义(P < 0.05)。

Fig 1 Expression of DNMT1 mRNA in Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h

图选项

MTT法检测DNMT1 siRNA对Molt-4细胞增殖率的影响，经0、30、60、120 nmol·L^-1的DNMT1 siRNA作用24、48、72 h后，Molt-4细胞的增殖率变化见Tab 1。结果显示，细胞的增殖率随着DNMT1 siRNA浓度的增加而逐渐下降；而且随着DNMT1 siRNA作用时间的延长，增殖率逐渐下降，说明其作用具有浓度依赖性和时间依赖性(Fig 2)，与对照组细胞增殖率相比，各处理组差异均有统计学意义(P < 0.05)。

Fig 2 Proliferation rates of Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24,48 and 72 h *P < 0.05 vs 0 nmol·L-1

图选项

经DNMT1 siRNA作用24 h后，0、30 、60、120 nmol·L^-1 siRNA组细胞凋亡率分别为(4.27±1.42)%、(15.25±1.54)%、(35.63±2.54)%、(66.27±3.02)%，结果显示：细胞凋亡率随着siRNA浓度增加而逐渐上升，说明其作用具有浓度依赖性。DNMT1 siRNA组与对照组凋亡率比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 3。

经0、30、60、120 nmol·L^-1DNMT1 siRNA作用Molt-4细胞24 h后，Western blot法检测结果显示，随着DNMT1 siRNA浓度递增，抑癌蛋白 P15的表达量呈现递增趋势；而DNMT1蛋白表达量呈现递减趋势。AlphaDigiDoc图像分析软件分析比较，各组条带灰度值与β-actin及对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 4。

Fig 3 Apoptotic rates of Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h

图选项

Fig 4 Alteration of DNMT1，P15 protein in Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h A: Protein electrophoresis； B: Proteins relative density. *P < 0.05 vs 0 nmol·L-1

图选项

经上述不同浓度的DNMT1 siRNA处理Molt-4细胞24 h后，结果显示：抗凋亡蛋白Bcl-2和胱天蛋白酶procaspase-3的表达量随着DNMT1 siRNA浓度的增加而递减，呈现浓度依赖性(P < 0.05)，差异有统计学意义(Fig 5)。

Fig 5 Alteration of apoptosis-related proteins in Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h A:Protein electrophoresis；B:Proteins relative density. *P < 0.05 vs 0 nmol·L-1

图选项

经上述不同浓度的DNMT1 siRNA处理Molt-4细胞24 h后，H3K4甲基化水平随siRNA处理浓度增加而表达逐渐增强，H3K9甲基化水平随着siRNA处理浓度的增加而逐渐降低；P < 0.05，差异有统计学意义。而组蛋白H3乙酰化水平未见明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 6。

Fig 6 Alteration of histone-related proteins in Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h A:Protein electrophoresis； B: Proteins relative density. *P < 0.05 vs 0 nmol·L-1

图选项

DNMT1是人体发育过程中必需的基因,定位于人类19pl3.2-19pl3.3,是人体内最早发现且最为重要的甲基转移酶^[6]，主要维持DNA甲基化。DNMT1 基因的高表达参与或影响恶性肿瘤的形成过程，启动子甲基化异常导致的转录失活是多种肿瘤发病的共同机制之一^[7]。研究发现：在胃癌、肝癌、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤临床样本中均检测到DNMT1蛋白的高表达^[8]，DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTis)对于治疗基因启动子区存在高甲基化的癌症有重要的意义^[9]。因此，本研究通过DNMT1 siRNA降低DNMT1基因的表达，从而逆转肿瘤抑制基因的高甲基化状态，抑制肿瘤的发生发展。

Kurita 等^[10]构建DNMT1 siRNA及 DNMT3b siRNA 转染肝癌细胞，发现siRNA抑制肝癌细胞的增殖及促进细胞凋亡。本研究显示：Molt-4细胞经不同浓度的DNMT1 siRNA作用后，增殖率逐渐下降，表现出时间依赖性和浓度依赖性，说明DNMT1 siRNA可阻滞细胞周期，抑制细胞增殖。研究还发现：DNMT1 siRNA可上调抑癌蛋白P15表达。p15基因作为细胞周期的负性调控因子，如果p15 基因失活，则P15 蛋白不能正常表达，细胞增殖失去控制，导致细胞癌变。p15基因缺失、突变、失活等在恶性血液病中容易发生，而且p15基因甲基化与血液病的疗效及预后也有关系^[11] 。本研究采用的急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞株，其p15基因高度甲基化，p15基因弱表达，对正常细胞周期不能发挥负性调控功能，导致细胞生长周期失调，细胞癌变。通过转染DNMT1 siRNA，上调p15基因和P15蛋白的表达水平，从而抑制肿瘤细胞增殖。

本研究显示，DNMT1 siRNA可诱导Molt-4细胞凋亡，随着DNMT1 siRNA浓度增加，Molt-4细胞凋亡率逐渐增高；同时procaspase-3及Bcl-2表达量逐渐递减，具有明显的浓度依赖性。推测沉默DNMT1可通过线粒体介导的通路(内在通路)发挥对Molt-4细胞株凋亡的调控，Bcl-2家族中促凋亡蛋白，诱发细胞色素C从线粒体释放入胞质，激活caspase-9前体，活化的caspase-9继而激活下游的caspase-3，引发caspases级联反应，诱导细胞凋亡发生，启动内源性凋亡通路。亦不排除受体介导的外源性凋亡通路参与的凋亡过程，其作用机制有待进一步研究。本研究通过DNMT1 siRNA转染Molt-4细胞，结果p15基因表达增加，Bcl-2表达降低，抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡，推测DNMT1 siRNA通过增加p15基因表达，降低Bcl-2表达，参与细胞周期调控过程。

本研究发现：DNMT1 siRNA可下调组蛋白H3K9甲基化水平，上调组蛋白H3K4的甲基化水平。DNMT1 siRNA抑制H3K9甲基化，解除对抑癌基因的转录抑制作用，从而使p15基因转录活性增加、表达水平增加，发挥细胞周期负性调控作用促使细胞周期停滞；Bcl-2表达水平下降，启动线粒体介导的通路，诱导细胞进入凋亡程序。DNMT1 siRNA干扰DNMT1基因表达，H3K4 甲基化水平升高，说明在基因沉默机制中，H3K9甲基化与DNA甲基化正相关，而H3K4甲基化与DNA甲基化负相关，具体机制有待进一步研究证实。由此可见，DNA 甲基化与组蛋白修饰之间存在密切的联系，DNMT1的N端与HDAC1、HDAC2结合,引起组蛋白去乙酰化；亦可招募赖氨酸特异性脱甲基酶1 (LSDl)和组蛋白甲基化酶Suv39hl,导致组蛋白不同的氨基酸去甲基化或甲基化。另外，组蛋白低乙酰化状态促进DNA甲基化，而组蛋白高乙酰化状态抑制DNA甲基化^[12]。有研究报道：DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’脱氧胞苷能改变组蛋白乙酰化状态^[13]，而本研究显示转染DNMT1 siRNA后，组蛋白H3乙酰化水平无明显变化，因此推测在DNA甲基化与组蛋白乙酰化相互之间的调控可能存在多样性。

本研究证实采用RNA干扰技术沉默DNMT1基因后，通过调控组蛋白的甲基化，重新启动基因转录，上调p15基因表达，裂解Bcl-2，激活caspase-3，启动线粒体介导的凋亡途径，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡。因此，在今后临床治疗中，有望通过siRNA沉默DNMT1基因，发挥抑癌作用，成为癌症基因治疗的有效手段。

(致谢：本文实验在闽南师范大学菌物产业工程技术中心实验室完成，感谢实验室的老师对本实验的支持。)