2. 中国医科大学基础医学院神经生物学教研室, 辽宁 沈阳 110001
刘云会(1962-),男,博士,教授,主任医师,研究方向:脑胶质瘤药物治疗及血肿瘤屏障开放,E-mail:liuyunhui2014@yeah.net
2. Dept of Neurobiology, College of Basic Medicine, China Medical University, Shenyang 110001, China
脑胶质瘤是常见的颅内原发性恶性肿瘤,即使联合手术、放疗及化疗等多种治疗手段,因其高度的恶性生物学行为常导致治疗效果的不理想。如何提高脑胶质瘤患者的疗效及生存率已经成为亟待解决的一大难题[1]。越来越多的报道指出,肿瘤内存在一小部分具有自我更新能力、多向分化潜能以及更强体内成瘤能力的细胞,称为“肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)”[2]。胶质瘤中肿瘤干细胞的存在也被证实是导致胶质瘤对化疗不敏感,对放疗抵抗及胶质瘤复发的根源[3, 4]。因此,寻求不仅能够对GSCs产生杀伤作用,同时又能够抑制GSCs干性维持的药物将最大程度上减少胶质瘤对治疗的抵抗及复发。
紫草素是从中药紫草中提取的萘醌类化和物,具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种药理活性[5]。在临床上紫草素用于对咽喉疼痛、烧伤、切割伤以及皮肤病的治疗[6]。近期越来越多的报道指出紫草素在多种肿瘤细胞中具有肿瘤杀伤作用[7, 8]。另有报道证明口服紫草素可延长晚期肺癌患者的生存期,未观察到毒副作用[9]。以上的研究结果提示紫草素在用于临床抗肿瘤治疗方面具有良好的应用前景,因此深入研究紫草素的抗肿瘤作用和机制具有重要意义。
我们之前的研究证实了紫草素能够通过诱导GSCs凋亡产生肿瘤杀伤作用[10]。但目前有关紫草素能否对GSCs的干性维持产生抑制作用及其相关分子机制的研究国内外尚未见报道。因此,本研究围绕紫草素对GSCs干性维持的影响及其相关分子进行了探讨,为紫草素能够有效用于抗胶质瘤的治疗提供进一步的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试剂和仪器DMEM和无血清干细胞培养基(DMEM/F12/Glutamax)购自Invitrogen公司; EGF、bFGF以及胎牛血清购自Gibco公司;紫草素和IGF-1购买于Sigma Aldrich公司,药品应用0.9%氯化钠溶液和DMSO进行配制;一抗抗体如CD133和nestin购买于Millipore 公司,PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt购买于Abcam公司;辣根过氧化物酶标记的二抗和GAPDH购自北京中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器:多功能酶标仪(Molecular Devices,美国),电泳装置(Bio-Rad,美国),荧光显微镜(Olympus BX61)。
1.2 细胞培养U87 MG胶质瘤细胞系购自American Type Culture Collection( < 30代),先以含10% FBS的DMEM培养液于培养瓶中培养,后转至无血清的神经干细胞培养液(含20 pg·L-1 bFGF及20 pg·L-1 EGF)中并加入B27补充剂培养提取GSCs。细胞均在37 ℃、饱和湿度及5% CO2的孵育箱内培养传代。
1.3 免疫荧光鉴定GSCsGSCs在4%多聚甲醛中固定30 min后,室温下用Triton X-100透核膜10 min。应用含5% BSA (bovine serum albumin) 的PBS进行封闭2 h后,于4 ℃下孵育一抗CD133和nestin过夜。孵育荧光二抗室温2 h后,应用DAPI染核10 min,PBS洗片后应用Olympus BX61 荧光显微镜进行检测。
1.4 单克隆形成实验胶质瘤细胞球解离成单个细胞后按照有限稀释法放入96孔悬浮培养板,标记出仅有1个细胞的培养孔,每天动态观察标记孔中单细胞的分裂及克隆形成情况。10 d后观察每孔悬浮生长的细胞球,以评价细胞球细胞的自我更新能力。
1.5 亚球形成实验胶质瘤细胞球解离成单个细胞后按照有限稀释法放入96孔悬浮培养板,调整每孔细胞数为50个,应用紫草素(2 μmol·L-1) 分别处理12、24 h及48 h后,96孔板进行离心以更换新鲜干细胞培养液。每天动态观察标记孔中子代细胞球的形成情况,观察至d 10计数每孔悬浮生长的2代细胞球个数,以评价紫草素对胶质瘤干细胞自我更新能力的影响。
1.6 Western blot蛋白表达检测分别收集紫草素(2 μmol·L-1) 和(或)IGF-1(50 μg·L-1) 处理的GSCs细胞,冰上裂解后离心,提取上清蛋白,紫外分光光度计法进行蛋白定量。10% SDS-PAGE凝胶电泳分离,通过电转移法将蛋白质转移到PVDF膜后,在含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h。加入一抗孵育过夜,TBST漂洗3次后,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温作用2 h,ECL法显色,GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。
1.7 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件,每组实验重复3次,所有数据均以x± s表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用One-way ANOVA检验。
2 结果 2.1 GSCs的分离和鉴定如Fig 1A所示,U87 MG细胞在含有10%胎牛血清的高糖培养液中以单层细胞贴壁生长。生长24~48 h后应用干细胞培养液进行分离培养,细胞以球形悬浮状态生长。此外,单克隆形成实验可见子细胞球的形成。如Fig 1B所示,免疫荧光染色检测到GSCs中干细胞表面标记物CD133和nestin的阳性表达。
2.2 紫草素抑制GSCs的干性维持如Fig 2所 示,2 μmol·L-1紫草素对GSCs分别作用0、12、24、48 h后,观察到紫草素作用24 h和48 h可导致GSCs的成球能力明显下降,紫草素作用48 h时光镜下观察到GSCs呈现贴壁分化生长;与对照组相比较,紫草素作用24 h和48 h组2代子细胞球形成数量明显减少;Western blot 证实了紫草素作用24 h 和48 h时GSCs的干细胞表面标记物CD133的表达明显降低。
2.3 紫草素抑制GSCs中PI3K/Akt信号通路如Fig 3所示,2 μmol·L-1紫草素对GSCs分别作用0、12、24、48 h后,观察到紫草素作用不同时间下PI3K和Akt的表达差异无统计学意义;与对照组相比较,p-PI3K和p-Akt的蛋白激活水平在紫草素作用24 h和48 h时产生了明显下降,48 h最为明显。
2.4 紫草素对GSCs干性维持产生的抑制作用依赖于PI3K/Akt信号通路如Fig 4所示,通过应用PI3K通路的激动剂IGF-1,我们观察到IGF-1可明显减弱紫草素对GSCs成球能力的抑制作用;IGF-1(50 μg·L-1)可明显逆转紫草素作用下GSCs中p-PI3K和p-Akt蛋白激活水平的下降;同时IGF-1可明显拮抗紫草素作用下对GSCs干细胞表面标记物CD133阳性表达的抑制作用。
3 讨论目前对于脑胶质瘤的治疗,即使采用手术、放疗和化疗等综合治疗仍然很难达到长期控制肿瘤[11]。肿瘤的治疗抵抗和复发是导致胶质瘤疗效不理想的主要因素。越来越多的报道指出,脑胶质瘤中GSCs的存在是导致脑胶质瘤对治疗产生抵抗和胶质瘤复发的根源[12]。因此,如何能够对GSCs进行有效的杀伤治疗是提高胶质瘤疗效的关键。近来有报道指出治疗过程中胶质瘤细胞可被诱导产生去分化,从而形成GSCs而导致疗效的降低[13],由此可见,降低GSCs的“干性”能够作为有效提高杀伤胶质瘤疗效的方法之一。
紫草素是逐渐被证实的一种具有良好应用前景的抗肿瘤药物。研究表明,紫草素可对多种肿瘤细胞产生杀伤作用,在乳腺癌、宫颈癌、肝癌及前列腺癌等肿瘤组织中被证实可通过诱导肿瘤细胞凋亡、坏死以及细胞周期阻滞以产生抗肿瘤作用[14, 15]。目前紫草素仅在乳腺癌中被证实能够影响肿瘤干细胞的“干性”[16],有关紫草素对其它肿瘤干细胞干性维持的影响国内外尚未见报道。
我们对紫草素杀伤胶质瘤干细胞的前期研究中证实了紫草素的IC50为2 μmol·L-1[10],因此本研究中,我们继续观察了2 μmol·L-1紫草素作用不同时间下对GSCs干性维持的影响。结果显示,紫草素作用24 h后能够明显地抑制GSCs悬浮细胞球的形成,减少二代细胞球形成的数量,同时能够明显降低GSCs干细胞表面标记物CD133的阳性表达,充分证实了紫草素对GSCs的干性维持具有抑制作用。
PI3K/Akt信号通路参与了包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞生理过程[17],同时也是常见的参与肿瘤细胞干性维持的信号通路之一,该通路在肿瘤细胞内的激活将有助于肿瘤干细胞干性的维持[18],因此我们进一步探讨了紫草素作用下GSCs中PI3K/Akt信号通路的变化。结果显示,PI3K和Akt的表达差异无统计学意义,紫草素作用24 h和48 h时p-PI3K和p-Akt的表达明显下降,提示PI3K/Akt信号通路可能参与到紫草素对GSCs干性维持抑制作用的分子机制中。为了充分验证这一假设,在本研究中我们进而应用了IGF-1,一种PI3K通路的常用激动剂。通过观察应用IGF-1对紫草素抑制GSCs干性维持的影响来明确紫草素对GSCs干性维持的抑制作用是否依赖于PI3K/Akt信号通路。结果显示给予IGF-1后可明显逆转紫草素作用下GSCs悬浮细胞球形成能力的下降以及CD133的低表达,表明了紫草素对GSCs产生干性维持抑制作用的分子机制可能与紫草素作用下GSCs中PI3K/Akt信号通路受到抑制有关。需要指出的是,PI3K/Akt信号通路下调也被证实可诱导细胞自噬的产生,同时自噬也被证实参与了干细胞的干性维持[19]。在胰腺癌中紫草素已经被证实能够诱导细胞产生自噬,但目前有关紫草素能否诱导胶质瘤细胞产生自噬的研究国内外尚未见报道。以上的研究结果提示我们可进一步围绕紫草素能否诱导GSCs产生自噬,并围绕自噬是否参与了紫草素对GSCs干性维持抑制作用的分子机制开展进一步的深入研究。
综上所述,本研究首次证实了紫草素能够抑制GSCs的干性维持。紫草素作用下GSCs中PI3K/Akt信号通路受到抑制可能是紫草素对GSCs产生干性维持抑制作用的主要分子机制之一。以上的研究结果为紫草素应用于抗胶质瘤的治疗提供了进一步的理论依据,同时表明了紫草素在抗人脑胶质瘤治疗中具有良好的应用前景。
(致谢:本实验在中国医科大学附属盛京医院中心实验室和中国医科大学神经生物学教研室完成,在此感谢所有曾给予过帮助的老师和同学们!)
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