香青兰(Dracocephalum moldovica L.)为唇形科香青兰属一年生草本植物[1]，是传统的维吾尔民族药之一。田蓟苷为唇形科青兰属植物香青兰中的主要有效成分[2, 3]，具有较高的新药研发潜力。前期研究结果表明，田蓟苷水溶性差，口服给药吸收不理想[4]。因此，为增加田蓟苷的溶解度，改善口服吸收利用率，课题组又进行了田蓟苷微乳制备工艺的研究[5, 6]，同时开展了田蓟苷微乳在大鼠小肠吸收特性的研究[7]，在此基础上，本实验采用 Caco-2 细胞模型对田蓟苷微乳的吸收机制进行研究，以期从细胞水平阐明田蓟苷微乳的吸收特性，为微乳载带田蓟苷的合理性提供科学依据。
1 仪器与方法 1.1 实验材料田蓟苷单体(纯度大于90%，自制)；田蓟苷对照品(纯度大于98%，自制)；田蓟苷微乳(实验室自制，批号：20141216)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜(美国Sigma公司)；Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Transwell 24、96孔板(美国Costar公司)；CO2恒温培养箱(美国SHEL-LAB公司)；Millicell-ERS电位仪(美国Millipore公司)；实验中Caco-2细胞株购自中科院上海细胞库，代数在50代之内。
1.2 色谱条件色谱柱：Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(35 ∶65)，流速：1.0 mL·min-1；柱温：25℃；PDA：检测器，检测波长：327 nm；进样量：20 μL；理论塔板数不低于5 000；拖尾因子：0.95~1.05；检测限：15 μg·L-1。
1.3 Caco-2细胞培养将Caco-2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。进行摄取或转运实验前，细胞接种于24孔板或Transwell小室中，细胞接种密度为8×107·L-1，培养14 d和21 d，满足跨膜电阻大于 600 Ω·cm-2的膜用于药物的跨膜转运实验。
1.4 Caco-2细胞摄取试验将细胞按8×107·L-1种植在24孔板中，培养14 d。田蓟苷溶液及稀释10倍的载药微乳加入各孔，培养板置于37℃培养。分别考察培养时间(15、30、60、120 min)，培养介质pH 5.0、6.0、7.0、8.0和抑制剂(P-糖蛋白抑制剂维拉帕米、Na+依赖葡萄糖转运载体抑制剂根皮苷、代谢抑制剂2,4-二硝基酚)对田蓟苷细胞吸收的影响。
1.5 Caco-2细胞转运试验取16.20 mg·L-1田蓟苷溶液和田蓟苷微乳稀释液分别加入Transwell的AP侧和BL侧，分别测定AP-BL及BL-AP的Papp值。
1.6 数据分析TEER=(Rtotal-Rblank)×A，其中Rtotal为实测电阻值，Rblank为测定空白膜的电阻值，A为膜面积。表观渗透系数Papp(cm·s-1)的计算：Papp =(dQ/dt)/(A×C0)，其中dQ/dt为单位时间药物转运量(mg·L-1·min-1)；A为转运膜的面积；C0为田蓟苷初始质量浓度(mg·L-1)。
2 结果 2.1 培养时间对Caco-2细胞吸收药物的影响Caco-2细胞对田蓟苷的摄取量随摄取时间的延长而逐渐增加，30 min达峰。田蓟苷、田蓟苷微乳峰浓度分别为(1.325±0.019)、(1.462±0.027) mg·g-1 protein，确定取样时间为30 min。
2.2 pH对Caco-2细胞吸收药物的影响随着pH值的增加，细胞对田蓟苷的摄取量逐渐降低，说明酸性环境有助于田蓟苷的吸收。细胞对田蓟苷微乳的吸收高于对田蓟苷的吸收，但差异无显著性。
2.3 抑制剂对Caco-2细胞吸收药物的影响维拉帕米可明显增加Caco-2细胞对田蓟苷的摄取，根皮苷、代谢抑制剂DNP可明显减少Caco-2细胞对田蓟苷的摄取，且细胞对微乳的摄取程度较单体的高。
2.4 Caco-2细胞转运试验田蓟苷单体BL-AP的Papp是AP-BL的1.10倍；田蓟苷微乳 BL-AP的Papp是AP-BL的1.22倍，都介于1.00~1.50之间，提示可能存在载体转运，且微乳稀释液对田蓟苷的转运优于田蓟苷单体。
3 讨论田蓟苷和田蓟苷微乳Caco-2细胞吸收比较结果显示，相同浓度下，细胞对田蓟苷微乳稀释液的吸收高于田蓟苷的吸收。
与对照组相比，加入2,4-二硝基酚(DNP)、根皮苷可使田蓟苷和田蓟苷微乳在Caco-2细胞的摄取减少，加维拉帕米可使田蓟苷和田蓟苷微乳的吸收明显增加，说明田蓟苷是P-gp、SGLT1的底物，微乳中的成分可抑制P-gp的外排作用、抑制SGLT1与田蓟苷的结合，从而促进Caco-2细胞对田蓟苷的吸收。提示田蓟苷微乳的吸收不单纯是被动转运，还存在载体媒介转运。
田蓟苷单体的AP-BL侧的Papp为(2.58±0.91)×10-6 cm·s-1，BL-AP侧的Papp为(2.83±0.45)×10-6 cm·s-1，田蓟苷微乳 BL-AP的Papp值为(2.63±0.32)×10-6 cm·s-1，AP-BL的Papp值(3.21±0.23)×10-6 cm·s-1，田蓟苷BL-AP侧的Papp与AP-BL侧的Papp值的比值为1.10，田蓟苷微乳 BL-AP的Papp是AP-BL的1.22倍，都介于1.00~1.50之间，进一步证明了田蓟苷和田蓟苷微乳的吸收不单纯是被动转运，还存在载体媒介转运。
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