2. 长春迪瑞医疗科技股份有限公司, 吉林 长春 130000;
3. 修正集团长春高新制药有限公司, 吉林 长春 130108
2. Changchun Dirui Medical Technology Co., Changchun 130000, China;
3. Changchun Gaoxin Pharmaceutical Co. of Xiuzheng Pharmaceutical Group, Changchun 130108, China
Apelin是一种心血管活性多肽,是由日本学者1998年利用反向药理学的方法从牛胃的分泌物中提取并纯化出的反义G蛋白偶联受体-血管紧张素受体AT1相关蛋白的天然配体[1],其对多种因素所致的心脏损伤均有保护作用[2]。参附汤(shenfu soup,SF)是由人参、附子组成的经典名方,附子、人参相使配伍,可达到减毒增效的作用[3]。现代药理学研究表明,SF具有增加冠脉流量,提高超氧化物歧化酶活性,改善血流动力学,抵抗心肌受损等功效[4, 5, 6, 7]。本文拟通过皮下多点注射ISO方法建立大鼠心肌缺血模型,测定心肌酶等含量变化及apelin表达情况,并通过相关性分析探讨SF抗心肌缺血时心肌酶与apelin表达变化的相关性,从而揭示SF抗大鼠心肌缺血损伤作用的相关机制,为临床用药提供理论和实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物♂ SD大鼠(180~200 g),吉林大学基础医学院实验动物中心,合格证号:SCXK-(吉)2012-0003。
1.1.2 药品与试剂ISO:上海科鉴生物科技有限公司,批号:100166-201204;CK、LDH检测试剂盒:南京建成生物工程研究所;apelin检测试剂盒:REF DRE21040 201304;Simply P总RNA提取试剂盒:杭州博日科技有限公司;Bio RT逆转录扩增试剂盒:杭州博日科技有限公司;SYBR GREEN PCR Master Mix试剂盒:杭州博日科技有限公司;参附注射液:雅安三九药业有限公司,批号120505;附子、人参购自于长春宏检药业,按附子 ∶人参(2 ∶1)的比例称取药材,常规煎煮浓缩并冻干备用。
1.1.3 仪器BL-420生物信号采集系统:成都泰盟科技有限公司;新世纪T6紫外分光光度计:北京普析科技有限公司;Model 680酶标仪:美国伯乐;低温高速离心机:德国Eppendorf公司;Bio Spec-nano:日本岛津公司;实时荧光定量PCR仪:美国安捷伦公司。
1.2 方法 1.2.1 筛选动物及实验分组将麻醉大鼠仰卧位固定于鼠板上,将针状电极插入四肢及胸前心尖搏动处皮下。记录胸前导联或Ⅱ导联心电图,观察是否正常,弃去ST段有异常变化者和心律失常者。取符合条件的大鼠60只,随机分为6组,每组各10只,分别为空白对照组(Sham),模型组(Model),参附注射液组(SF injection),参附汤低、中、高剂量组,普食喂养,自由饮水。
1.2.2 造模及给药方法空白对照组:灌胃蒸馏水;模型组:灌胃蒸馏水,并于实验d 11,灌胃后30 min立即腹腔注射2 mg·kg-1 ISO,30 min后将大鼠放入冰水中游泳5 min;参附注射液口服组:6.67 mg·kg-1参附注射液灌胃,其他同模型组;参附汤低、中、高剂量组:3、6、12 g·kg-1参附汤灌胃,其他同模型组。各组大鼠于给药d 15后腹腔注射20%乌拉坦 5 mL·kg-1麻醉,采用BL-420生物信号采集系统测量各组大鼠的ST段心电。腹主动脉取血,3 000 r·min-1离心15 min,取上清,冻存备用;一部分心脏迅速放入液氮中冻存,一部分心脏放入福尔马林固定液中固定。
1.2.3 HE染色检测大鼠心肌组织形态学改变情况腹腔注射20%乌拉坦5 mL·kg-1麻醉大鼠,取心脏,用预冷生理盐水冲洗干净,放入10%福尔马林中固定24 h,石蜡包埋标本,切片,行HE染色,Leica光学显微镜下观察心肌组织形态学情况。
1.2.4 血清相关蛋白含量检测末次给ISO后24 h,麻醉大鼠,腹主动脉取血,肝素抗凝,3 000 r·min-1离心15 min,取上清,按照试剂盒说明书中操作方法检测血清CK、LDH及apelin含量。
1.2.5 Real-time RT-PCR检测心肌组织中apelin mRNA的表达取冷冻心肌组织标本,按照Simply P总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA;吸取1 μL总RNA用Bio Spec-nano检测浓度;按照两步法Bio RT逆转录扩增试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA;参照Bio Easy SYBR Green I Real Time PCR Kit Manual说明书,采用三步法程序进行荧光定量PCR扩增,94℃预变性2 min,94℃变性10 s,60℃退火15 s,72℃延伸30 s,共40个循环;最后72℃延伸10 min。在30℃~95℃区间内进行融解试验,并绘制融解度曲线,目标基因表达相对定量分析2-ΔΔCt法。
Gene | Forward primer (5′-3′) | Reverse primer (5′-3′) |
apelin | CTGTATGCCTCTGGTCGTAC | TGATGTCACGCACGATTTCC |
β-actin | TGCTCTGGCTCTCCTTGACT | ATGGGTCCCTTATGGGAGAG |
采用SPSS 13.0统计学软件处理,经正态分布和方差齐性检验后,采用方差分析法,组间两两比较采用LSD法。实验数据均以 ± s表示。
2 结果 2.1 行为学观察实验期间空白组大鼠活泼好动,毛发整齐有光泽,呈白色,不易脱落,抓取时主动逃避,反抗较剧;而模型组大鼠造模后活动较少,嗜睡,精神萎靡,毛色枯槁,多倒竖,易脱落,抓取时反抗较轻。
2.2 参附汤对大鼠心肌组织形态学的影响与空白组比较,各组大鼠心脏心内膜不同程度的呈弥漫性心肌组织坏死,炎症细胞浸润,纤维组织增生,以模型组最为严重,而各给药组坏死程度明显减小。见Fig1。
2.2 参附汤对大鼠血清相关蛋白含量的影响与空白组相比,模型组大鼠CK、LDH值明显升高(P < 0.01),而apelin含量明显降低(P < 0.01)。与模型组相比,参附注射液组、参附汤低、中、高剂量组CK值均有一定程度的降低,除参附汤低剂量组外,差异均具有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01);与模型组相比,各给药组LDH值均明显降低(P < 0.05或P < 0.01);而参附注射液组、参附汤中、高剂量组中apelin含量与模型组相比,均明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。见Tab2。
( ± s,n=10) | ||||
Group | Dosage/g·kg-1 | CK/U·L-1 | LDH/U·L-1 | apelin/ng·L-1 |
Sham | - | 73.15±4.30 | 539.78±75.68 | 887.12±104.31 |
Model | - | 94.75±3.78△△ | 961.15±68.34△△ | 341.17±35.21△△ |
SF injection | 6.67 | 78.76±7.23** | 687.22±90.86* | 628.04±99.74** |
SF | 3 | 89.11±3.8 | 823.08±58.24** | 459.12±83.56 |
6 | 83.91±6.85* | 700.70±119.62** | 527.05±112.75* | |
12 | 81.43±3.72** | 727.52±72.47** | 615.46±109.12** | |
△△P < 0.01 vs Sham; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
血浆apelin与心肌酶CK、LDH的相关分析显示,apelin与CK、LDH呈负相关(r=-0.819和r=-0.794,P=0.000),存在相关性。
2.4 参附汤对心肌缺血大鼠心肌组织中apelin mRNA表达的影响Real-time PCR检测结果显示,模型组大鼠心肌组织apelin mRNA明显下降(P < 0.01)。参附注射液组和参附汤中、高剂量组均可以明显上调由ISO素所致的apelin mRNA下降(P < 0.01);参附汤低剂量组也有上调的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见Fig2。
3 讨论Apelin在体内分布广泛,中枢与外周组织均有不同水平的表达,尤其在不同组织血管的内皮细胞中均有表达,与心血管的发育和功能有关[8]。本实验结果显示,与空白组相比,模型组血浆apelin含量明显降低;同时,与模型组相比,各给药组大鼠血浆中apelin含量均有所升高,其中参附注射液组、参附汤中、高剂量组中apelin含量与模型组相比,明显升高。以上结果提示参附汤可能通过影响apelin水平改善缺血心肌血管舒缩功能,从而发挥抗心肌缺血损伤作用。
CK、LDH等酶广泛存在在心肌组织细胞中,在维持心肌正常生理功能方面发挥着重要的生理作用[9],血清中CK、LDH值在正常情况下要比组织中低1000倍左右[10]。研究表明,心肌缺血后代谢紊乱,心肌组织严重损伤,各种酶被释放出来,其中血清CK、LDH 含量明显增加,其升高程度与心肌梗死程度相平行且有加重缺血对心肌的损伤作用[10, 11, 12, 13]。在本研究中,模型组大鼠血清中 CK、LDH 含量明显升高,说明心肌细胞受损;此外,各给药组可明显降低急性心肌缺血大鼠血清中CK、LDH含量,表明参附汤能够加强对心肌缺血时氧自由基的清除能力,增强心肌细胞有氧代谢,减轻心肌细胞变性及心肌组织的损害。同时,相关性分析结果显示,血浆apelin含量与心肌酶CK、LDH含量存在相关性。由此推测,参附汤抗心肌缺血损伤的机制可能与其明显增加apelin表达,进而降低心肌酶CK、LDH表达作用密切相关。
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