2. 河北以岭医药研究院, 河北 石家庄 050035;
3. 河北医科大学附属以岭医院, 河北省中医药络病理论指导糖尿病足防治重点研究室, 河北 石家庄 050091
2. Hebei Yiling Medicine Research Institute, Shijiazhuang 050035, China;
3. Yiling Hospital Affiliated of Hebei Medical University, Key Laboratory of Collateral Disease Theory Guidance in Prevention and Treatment of Diabetic Foot of Chinese Traditional Medicine in Hebei Province, Shijiazhuang 050091, China
糖尿病足是糖尿病最严重的和治疗费用最高的慢性并发症之一,重者可导致截肢,下肢截肢的相对风险是非糖尿病患者的40倍[1]。随着干细胞移植技术在再生医学的不断发展,应用干细胞移植正成为治疗糖尿病足的新方法,近年来研究发现[2],干细胞移植到缺血组织内分化成内皮细胞(endothelial cell,ECs),直接形成新的血管,又可通过旁分泌血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素-2、血管生成素-1等多种血管生成因子来参与血管的新生。且研究发现通心络可以通过改善心肌梗死区微环境,增加干细胞移植后存活[3],增加新生血管、建立侧枝循环,增加糖尿病足缺血下肢血流灌注量[4]。因此,本实验就通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗糖尿病足大鼠促进其缺血下肢血管生成中的作用进行研究,以探讨其涉及的分子机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物健康SPF级♂ SD大鼠70只,4周龄,体质量190~230 g,动物合格证号:SCX K(京)2009-0017,由中国食品药品检定研究院提供,同源异体供体大鼠为清洁级♂ SD大鼠10只,15周龄,约300 g左右,许可证号:SCXK(京)2009-0007,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。饲养在河北以岭医药研究院药理实验室,光照12 h·d-1,温度22~24℃,相对湿度50%~70%,每日正常饲料喂养。
1.2 药物通心络原粉(由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成,每克含1.47 g生药,石家庄以岭药业股份有限公司提供,批号20120924)用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制,4℃保存。
西洛他唑片(浙江大冢制药有限公司,批号130801P)用0.5%羧甲基纤维素钠溶液现配。
1.3 实验试剂链脲佐菌素(STZ,美国Amresco公司,批号:1262C443),重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF,深圳新鹏生物工程有限公司,批号:201302009),细胞处理试剂盒(河北博海生物工程开发有限公司,批号:20140428),CD90、CD105、CD49A、CD49B、CD49C、CD29、CD104磁珠(德国美天旎公司,批号:30.APR.2013),CD105-FITC、CD44-FITC、CD34-FITC(德国美天旎公司,批号:30.APR.2013),4、6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI,河北博海生物工程开发有限公司,批号:20130808),缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)试剂盒(上海西唐生物科技有限公司,批号F15647),血管内皮生长因子A(VEGF-A)试剂盒(上海森威科技有限公司,批号1407065),VEGF-A Rabbit polyclonal IgG(ab183100,英国Abcam公司),VEGF-R2 Rabbit polyclonal IgG(ab39256,英国Abcam)
1.4 设备与器材AL204精密分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司),干细胞磁性分选架、分选器、分选柱(德国美天旎公司),逆转录酶(M-MLV)、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)、dNTP、Taq DNA polymerase、随机引物(Random primers)(美国Promega公司),荧光定量PCR试剂盒(美国BBI公司),170-930型电转膜仪、170-3940型半干转膜仪、165-8001型垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)
1.5 方法 1.5.1 大鼠外周血间充质干细胞(Peripheral blood derived mesenchymal stem cells,PB-MSCs)分离10只清洁级♂ SD大鼠,每日皮下注射G-CSF 50 μg·kg-1,连续5 d,d 6全麻下腹主动脉用含有肝素抗凝管采血10 mL,密度梯度离心分离外周血单核细胞,确定细胞数量,重新悬浮细胞后加入CD90/CD105/CD49a/CD49b/CD49c/CD29/CD104微珠、混匀、孵育、离心,弃上清。用MS柱放于MACS分选器磁铁部位,将细胞悬液加到柱子中,收集通过柱子阴性的细胞。将分选柱与分选磁铁分离,冲洗掉柱子中带磁性标记的细胞,收集得到的是目的细胞即干细胞。加入0.1 mL无菌的DAPI溶液染色。用RPMI1640培养基稀释至4 mL(干细胞浓度0.5~2.0×109·L-1),冰上保存,计数细胞数,收集干细胞,以备移植。
1.5.2 模型制备参照文献[5, 6]的造模方法并进行改进。造模大鼠采用高脂喂养(热量配比:脂肪59.8%,碳水化合物20.1%,蛋白质20.1%)8周,禁食16h后腹腔注射STZ(35 mg·kg-1),正常对照组注入同体积的柠檬酸钠缓冲溶液,72 h后测尾尖血糖在16.7 mmol·L-1以上者入选为糖尿病模型。入模组和对照组大鼠于10%水合氯醛腹腔注射麻醉下,仰卧固定备皮消毒后,纵行切开右侧腹股沟正中皮肤,于腹股沟下分离出股动脉和股静脉,结扎并剪断股动脉和股静脉,伤口局部涂撒青霉素,缝合皮肤。
1.5.3 分组及给药将糖尿病足大鼠随机分为模型组、通心络组(TXL)、西洛他唑组(cilostazol)、外周血间充质干细胞组(干细胞组,PB-MSCs)、通心络联合外周血间充质干细胞组(通心络联合干细胞组,T-MSCs)、西洛他唑联合外周血间充质干细胞组(西洛他唑联合干细胞组,C-MSCs),每组10只,对照组(单纯手术组,n=10)、模型组和干细胞组大鼠以等体积的生理盐水灌胃,通心络组和通心络联合干细胞组给予通心络0.4 g·kg-1,1 次/天灌胃,西洛他唑组和西洛他唑联合干细胞组给予西洛他唑18 mg·kg-1,1 次/天灌胃;干细胞组、通心络联合干细胞组及西洛他唑联合干细胞组术后3 d沿股动脉走向、多点肌肉注射给予干细胞移植1.0×109·L-1,对照组、模型组、通心络组和西洛他唑组同点肌肉注射等体积无菌RPMI1640培养基。
1.6 观察项目 1.6.1 大鼠血清VEGF-A和HIF-1α水平检测取出冻存血清样品,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清VEGF-A和HIF-1α水平,严格参照试剂盒说明书操作,设立标准品浓度,酶标仪自动拟合标准曲线,通过检测待测孔OD值,得到样本VEGF-A和HIF-1α含量。
1.6.2 RT-PCR方法测定VAGF-A mRNA的表达参照文献[7],实验结束后处死大鼠,取缺血下肢肌组织,提取总RNA,按试剂盒说明加样进行逆转录反应,荧光定量qPCR仪扩增。引物合成:VEGF-A(145bp):上游5′-TGCTCCTTCACTCCCTCAAAT-3′,下游5′-TGTCCCTCTCTCTGTTCGCT-3′;内参照β-actin(105 bp):上游5′-GGTCATCACCATTGGCAA-3′,下游5′-GAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3′。用仪器自带的分析软件,将对照组设定为1,以相对定量值RQ用于统计分析。
1.6.3 Western blot法检测VEGF-A和VEGF-R2蛋白的表达实验结束后处死大鼠,称取大鼠缺血下肢肌组织加入组织裂解液,匀浆后4℃离心分离上清,进行蛋白定量。取各组蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干转膜后封闭,与一抗结合后洗膜,二抗结合,洗膜后采用增强型ECL化学发光法显色,扫描灰度值,以目的蛋白与内参GAPDH比值表示。
1.7 统计学方法采用SPSS 22.0 统计软件分析,所有数据用 ± s表示,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用最小显著差法(LSD法)。
2 结果 2.1 各组大鼠血清VEGF-A和HIF-1α水平比较与对照组比较,模型组血清VEGF-A和HIF-1α水平明显降低(P < 0.01)。与模型组比较,各用药组血清VEGF-A水平均明显升高(P < 0.05,20151220),T-MSCs和C-MSCs血清HIF-1α水平明显升高(P < 0.01)。T-MSCs和C-MSCs血清HIF-1α水平高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P < 0.05)。见Tab1。
( ± s,n=10) | ||
Group | VEGF-A/ng·L-1 | HIF-1α/ng·L-1 |
Control | 23.80±4.50 | 199.93±29.34 |
Model | 15.13±3.53** | 152.90±20.18** |
TXL | 19.19±3.97△△ | 160.96±20.21 |
Cilostazol | 18.71±2.47△ | 159.30±20.10 |
PB-MSCs | 18.46±2.69△ | 159.55±31.46 |
T-MSCs | 19.96±2.29△△ | 187.36±41.89△△#▲○ |
C-MSCs | 19.63±3.11△△ | 185.85±25.72△△#▲○ |
**P < 0.01 vs control;△P < 0.05,△△P < 0.01 vs model;#P < 0.05 vs TXL;▲P < 0.05 vs Cilostazol;○P < 0.05 vs PB-MSCs |
与对照组比较,模型组肌组织中VEGF-A和miR-210 mRNA表达明显降低(P < 0.01)。与模型组比较,各用药组肌组织中VEGF-A和miR-210 mRNA表达均明显升高(P < 0.01)。各用药组组间比较,T-MSCs肌组织中VEGF-A和miR-210 mRNA表达高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P < 0.01);PB-MSCs肌组织中VEGF-A mRNA表达高于TXL和Cilostazol(P < 0.05);TXL和PB-MSCs肌组织中miR-210 mRNA表达高于Cilostazol(P < 0.01)。见Tab2。
( ± s,n=5,RQ value) | ||
Group | VEGF-A | miR-210 |
Control | 1.04±0.17 | 1.08±0.13 |
Model | 0.29±0.06** | 0.24±0.02** |
TXL | 0.46±0.05△△ | 0.60±0.04△△ |
Cilostazol | 0.48±0.05△△ | 0.43±0.05△△## |
PB-MSCs | 0.62±0.12△△#▲ | 0.60±0.08△△▲▲ |
T-MSCs | 0.87±0.09△△##▲▲○○ | 0.76±0.14△△##▲▲○○ |
C-MSCs | 0.90±0.08△△##▲▲○○ | 0.65±0.10△△▲▲ |
**P < 0.01 vs control;△△P < 0.01 vs model;##P < 0.01 vs TXL;▲P < 0.05,▲▲P < 0.01 vs Cilostazol;○○P < 0.01 vs PB-MSCs |
与对照组比较,模型组肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达明显降低(P < 0.01)。与模型组比较,各用药组肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达均明显升高(P < 0.01)。各用药组组间比较,PB-MSCs肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达均高于Cilostazol(P < 0.05);T-MSCs和C-MSCs肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达均高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P < 0.01)。见Fig1,Tab3。
( ± s,n=3) | ||
Group | VEGF-A | VEGF-R2 |
Control | 1.06±0.04 | 0.81±0.03 |
Model | 0.28±0.01** | 0.12±0.03** |
TXL | 0.76±0.04△△ | 0.38±0.01△△ |
Cilostazol | 0.74±0.04△△ | 0.30±0.04△△## |
PB-MSCs | 0.81±0.04△△▲ | 0.43±0.02△△▲ |
T-MSCs | 0.97±0.04△△##▲▲○○ | 0.65±0.04△△##▲▲○○ |
C-MSCs | 0.95±0.01△△##▲▲○○ | 0.59±0.02△△##▲▲○○☆ |
**P < 0.01 vs control;△△P < 0.01 vs model; ##P < 0.01 vs TXL;▲P < 0.05,▲▲P < 0.01 vs Cilostazol;○○P < 0.01 vs PB-MSCs;☆P < 0.05 vs T-MSCsx |
临床研究发现,糖尿病足患者因其长期高血糖,不仅能促进血管病变致严重缺血性疾病,而且同时伴有侧枝血管形成能力的严重损伤[8]。因此其治疗关键环节是怎样促进缺血状态下血管新生及侧枝循环形成,改善缺血血供。目前应用干细胞移植治疗糖尿病足,是通过其可促进缺血肢体的新生血管形成,改善和恢复肢体血流,从而达到治疗目的[9]。中医脉络学说认为,基于中医脉与西医血管,脉络与中小血管、微血管、微循环在解剖形态学上的密切相关性,提出“脉络-血管系统病”概念[10]。糖尿病足是糖尿病日久累及肢体大、中、小、微血管的一类并发症,属于中医“消渴脱疽”范畴,可见糖尿病足亦属于“脉络-血管系统病”研究的范畴。通心络是脉络学说指导下研制的中药复方制剂,具有益气活血化瘀、搜风通络止痛[11]。既往临床研究发现通心络联合自体干细胞移植可以改善干细胞移植环境,提高糖尿病足临床疗效,且治疗效果优于单纯干细胞移植[12]。因此本实验探讨HIF-1/VEGF通路及miR-210基因表达在通心络联合外周血间充质干细胞移植促进糖尿病足缺血下肢血管新生中的作用机制。
血管新生受多种激酶和生长因子的调节,而VEGF-A是公认最有效、快速的血管渗透机制诱导因子[13],其主要通过两种酪氨酸激酶受体VEGF-R1(fit-1)和VEGF-R2(KDR/flk-1)在ECs上发挥作用[14],而VEGF-R2在VEGF所诱导的血管生成中起主要作用[15]。本实验结果显示,模型组血清、肌组织中VEGF-A表达明显降低,与既往临床研究结果相同[16],说明VEGF是DF发生和发展的重要影响因素,VEGF水平低下可能是导致DF缺血、溃疡,且经久不愈的重要原因。各用药组血清、肌组织中VEGF-A表达明显升高,肌组织中VEGF-R2蛋白表达明显升高,说明各用药通过增加肌组织中VEGF-A和VEGF-R2表达,升高血清VEGF-A水平,刺激ECs生长,促进缺血区血管新生。尤其是通心络联合干细胞组肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达最为明显,说明通心络通过上调VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达,而进一步提高干细胞移植治疗DF后新生血管形成的数量。
VEGF的表达受多种因素的调控,缺氧是迄今为止所发现的最强的调节因子。低氧诱导因子-1(HIF-1)作为一种转录因子在低氧条件下通过促VEGF基因转录[17],在调节组织新生血管的生成中发挥重要作用。本实验结果显示,通心络联合干细胞组血清中HIF-1α水平最高,优于通心络组、西洛他唑组及干细胞组,提示在缺血缺氧条件下,通心络联合干细胞移植通过升高HIF-1α水平表达,促进VEGF基因表达,进而促进血管新生。
微小核糖核酸(miRNA)是一类具有转录后调节活性的高度保守的非编码小分子RNA,在血管新生的调节中起重要作用。有研究发现miR-210可直接或间接靶向缺血后血管新生途径,参与血管新生的调控[18]。在缺氧条件下,miR-210过度表达能促进毛细管状结构的形成和VEGF介导的ECs迁移[19]。抑制miR-210的表达可减少血管形成和ECs迁移[20]。本实验结果显示,模型组肌组织中miR-210基因水平明显降低,说明持续的高糖状态可能通过抑制miR-210的表达,而减少血管形成和ECs迁移。各用药组肌组织中miR-210基因水平明显升高,其中通心络联合干细胞组肌组织中miR-210基因水平优于通心络组、西洛他唑组及干细胞组,提示持续高糖状态下,通心络联合干细胞移植通过上调miR-210基因表达,促进毛细管状结构的形成和ECs迁移。
因此推测通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗糖尿病足具有血管新生的作用,其作用机制可能是通过激活HIF-1/VEGF通路及miR-210基因的表达而发挥作用,且其进一步机制可能是通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗糖尿病足通过调节miR-210基因表达,进而激活HIF-1/VEGF通路促进了新生血管形成。
(致谢:本实验在河北省络病重点实验室完成。感谢河北省络病重点实验室的各位老师!)
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