类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种发病原因不明，累及全身关节的慢性自身免疫疾病，RA以滑膜炎症、滑膜组织增生、骨及软骨的破坏为主要病理特征^[1]。滑膜成纤维细胞(synovial fibroblasts,FLS)参与了RA发展进程中的免疫应答、血管新生和关节破坏等病理过程^{[2, 3]}。临床研究表明，RA患者的RA-FLS与正常的FLS细胞相比，具有增殖活跃、凋亡抑制，分泌高水平促炎性细胞因子等特征，是类风湿药物研究及治疗的重要靶细胞。由于RA患者FLS来源较少，建立与RA -FLS 相似特征的动物细胞模型AA大鼠滑膜成纤维细胞(AA-FLS)对抗RA 药物筛选及开发是非常必要的。本项研究在前期RA动物模型成功复制的基础上，成功建立了AA-FLS体外原代培养方法，并对AA-FLS的细胞状态、增殖活性、细胞凋亡水平及细胞因子分泌水平及线粒体通路调控蛋白Bcl-2和Bax及Pro-caspase-3和Cleave-caspase-3表达水平进行分析，综合评价AA-FLS的生物特性，探讨AA-FLS作为抗RA的体外研究细胞模型的可行性。

SPF级SD大鼠20只，♂，体质量(160±20) g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2011-0015。适应性喂养3d后随机分为2组，正常对照组10只，AA模型组10只。

热杀死结核分枝杆菌H37Ra，由Difco实验室提供(Detroit,MI,USA)；矿物油，美国Sigma；Ⅰ型胶原酶，美国Sigma；0.25% EDTA胰蛋白酶，美国Gibco；胎牛血清，中国四季青；双抗，美国Gibco；DMEM培养液，美国Hyclone；TNF-α；DMSO；生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒(SP-9000)、DAB显色试剂盒，北京中杉金桥公司产品；苏木精伊红(HE)染色试剂盒，碧云天公司产品；Cell Counting Kit-8(CCK-8),日本同仁；Hochest 33258试剂盒，凯基生物技术有限公司；Anti-Bcl-2 antibody、 Anti-Bax antibody、Anti-Caspase-3 antibody、Anti- vimentin antibody、Anti-CD68 antibody,美国Abcam；TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒，北京达科为公司产品。

电子天平，德国Sartorius公司；超净工作台，波兰shel-Lab；IX51倒置显微镜，日本Olympus株式会社；二氧化碳恒温培养箱，新加坡Esco公司；MK3型酶标仪，芬兰TECAN GENios公司。

Mtb诱导SD大鼠建立类风湿关节炎大鼠模型见课题组前期研究^{[4, 5]}。大鼠免疫Mtb 后18 d，腹腔注射100 g·L^-1水合氯醛麻醉，处死后固定在超净工作台内，取双侧后膝关节滑膜组织，PBS缓冲液冲洗3次，加入4 g·L^-1胶原酶Ⅰ浸没组织，用眼科剪快速剪碎组织1~2 min，于37℃，5% CO₂的培养箱中孵育4 h。2 800 r·min^-1，4℃离心10 min，用含10% FBS的DMEM培养基与沉淀混匀，均匀铺于培养皿中，放入37℃，5% CO₂培养箱中培养，d 2换液。

弃去旧培养基，用PBS缓冲液洗2次，加入含EDTA胰酶消化细胞，轻轻晃动培养皿使胰酶消化液覆盖细胞。消化完全后加入DMEM完全培养基终止消化，吹打培养皿收集细胞，800 r·min^-1离心5 min，弃上清液，用DMEM完全培养基重悬细胞，混匀后均匀铺于培养皿中，37℃、5% CO₂培养箱中培养。

在倒置显微镜下观察各代滑膜成纤维细胞的形态，生长状态和细胞纯度。显微镜下观察到的呈梭形细胞为滑膜成纤维细胞，圆形、椭圆形为巨噬样滑膜细胞。观察每次传代后滑膜成纤维细胞形态和细胞所占比例的变化情况。

将指数生长期的AA-FLS接种于置有10 mm×10 mm盖玻片的6孔板内，加入DMEM完全培养基，37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h，倒置显微镜下观察细胞爬片良好时，将爬片取出，按以下步骤进行HE染色：多聚甲醛固定15 min，PBS洗2 min，苏木精染10 min，蒸馏水冲洗多余染色液，PBS洗数秒，体积分数0.95的乙醇5 s，伊红染2 min，体积分数0.70乙醇洗2次，显微镜下观察。

将传代至第3代的AA-FLS铺于96孔板内，细胞同期化后，冷PBS洗3次，多聚甲醛固定15min，Triton-X-100室温孵育20 min，H₂O₂孵育15 min灭活内源性过氧化物酶活性，正常山羊血清工作液室温封闭15 min，倒去。抗大鼠vimentin抗体和抗大鼠CD68抗体(1 ∶200稀释)4℃孵育过夜，阴性对照用PBS代替一抗。PBS洗3次，滴加生物素标记山羊抗兔IgG室温孵育15 min，PBS洗3次后，SP室温孵育15min，DAB显色，苏木精复染，倒置显微镜下观察滑膜成纤维细胞vimentin的表达情况。

取对数生长期的AA-FLS和正常大鼠FLS细胞，以DMEM完全培养基制备成2×10⁷个·L^-1的细胞悬液，以每孔200 μL分别接种于96孔板中，细胞同期化后AA-FLS组和正常大鼠FLS组换同体积新鲜的DMEM完全培养基，每组5个复孔，分别培养1～7 d。培养结束后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度，绘制AA-FLS和正常大鼠FLS的生长曲线，比较两种细胞的增殖活性。

收集生长状态良好的对数生长期的AA-FLS和正常大鼠FLS(培养液中漂浮细胞800 r·min^-1，离心5 min收集；贴壁细胞以胰蛋白酶消化，离心收集)，收集好的细胞用PBS缓冲液洗2次，去上清，用甲醛溶液4℃固定15 min，PBS洗2次，离心去上清后用PBS缓冲液调整细胞浓度为1×10⁸个·L^-1，吸取50 μL细胞悬液，以盖玻片均匀涂片，自然风干，滴加50 μL的Hoechst 33258溶液在细胞涂片上，室温避光染色10 min，用流水冲洗多余染料，UV显微镜下观察细胞并拍照记录。每组细胞取10个视野，每个视野内计数不少于20个细胞核，计数凋亡细胞核数量，并计算各组细胞凋亡率。

分别收集AA-FLS和正常大鼠FLS的培养基，4℃，6 000 r·min^-1离心5 min，取上清液备用。设置空白组、标准品组和实验组，每组3个复孔，按ELISA检测试剂盒说明书操作，绘制标准曲线并计算出数据。

收集对数生长期的细胞，提取细胞总蛋白，取40 μg以SDS-PAGE电泳分离。低温条件下以恒定电流250Ma转膜90 min。转膜结束后，将PVDF膜用封闭液室温封闭2 h，用TBS-T洗膜3次×5 min。Bcl-2、Bax和Caspase-3一抗以1 ∶1 000比例稀释，将PVDF膜放入相应的蛋白一抗液体中，4℃孵育过夜，TBS-T洗膜3次×5 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，用TBS-T洗膜后，ECL法曝光显影。

实验结果以±s表示，数据采用SPSS 19.0统计软件处理，采用完全随机设计的方差分析和t检验法进行统计学分析。

通过胶原酶法分离获得的原代AA-FLS多为扁圆形或不规则多边形，围绕一些细小的组织块呈辐射状生长，其中混有大量的圆形巨噬样滑膜细胞；经传代后细胞渐伸展为梭形，混杂的巨噬样滑膜细胞数量渐渐减少；传代至第3代之后的细胞，典型梭形形态的细胞占0.95以上且鲜有巨噬样滑膜细胞；第5代以后的细胞开始老化，细胞形态发生变化，有的细胞开始皱缩为类圆形，细胞内出现空泡，细胞间隙增大(Fig1)。HE染色结果显示，AA-FLS形态规则，呈梭形，其细胞核为卵圆形位于细胞中央(Fig2)。免疫细胞化学结果显示，AA-FLS的vimentin表达为阳性，细胞内分布棕黄色颗粒，而CD68细胞几乎不着色为阴性表达(Fig3)。根据细胞来源、形态和免疫细胞化学检测结果可知，分离所得细胞为滑膜成纤维细胞。

Fig.1 Morphology of primary AA-FLSs(×100) A~D：the 1st generation to the 4th generation of AA-FLSs;E~F: the 6th generation to the 7th generation of AA-FLSs

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Fig.2 Morphological observation of AA-FLSs(×400,HE stain)

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Fig.3 Immunocytochemical identification of levels of AA-FLSs characteristic maker A: Vimentin (+) (×200); B: CD68(-) (×200)

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细胞经传代后1~3 d增殖较缓慢，两种细胞的生长曲线均呈平缓上升趋势；d 4~7细胞的增殖速度加快，从d 4开始AA-FLS的增殖速度明显高于正常大鼠的FLS细胞，差异有统计学意义(P < 0.05)(Fig4)。

Fig.4 Proliferation curve of AA-FLS and FLS *P < 0.05 vs FLS group

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用ELISA法对AA-FLS和正常大鼠FLS细胞上清液中的TNF-α及IL-1β水平进行测定。测定结果显示，AA-FLS的TNF-α、IL-1β的表达水平与正常FLS比较升高，差异有统计学意义(P < 0.01)(Fig5)。

Fig.5 Expression of TNF-α and IL-1β in AA-FLSs **P < 0.01 vs FLS group

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采用Hoechst 33258法分别对正常大鼠FLS和AA-FLS细胞进行染色，在荧光显微镜下观察拍照并记录试验结果。Hoechst 33258为非嵌入型荧光染料，能够在活细胞中DNA聚AT序列富集区域小沟处与DNA结合，从而使细胞核着色。未发生凋亡的活细胞因核DNA结构相对保持完整，与Hoechst 33258染料结合较少，在荧光显微镜下呈现弥散、微弱的淡蓝色荧光。凋亡状态的细胞，由于DNA发生断裂，能够充分与Hoechst 33258染料结合，在荧光显微镜下呈亮蓝色荧光。根据实验结果显示(Fig6、7)，正常大鼠FLS细胞在UV显微镜下多数细胞核呈淡蓝色荧光，少量细胞核呈明显亮蓝色荧光，细胞凋亡率为(11.828±1.445)%；AA-FLS细胞呈凋亡抑制趋势，显微镜下观察细胞核呈现弥散状的微弱蓝荧光，极少细胞出现亮蓝色荧光，细胞凋亡率为(7.512±0.824)%,与正常FLS细胞组相比较差异具有统计学意义(P < 0.01)。

Fig.6 Hoechst 33258 stain assay (×200) A:FLS; B:AA-FLS.

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Fig.7 Apoptotic rate in AA-FLS **P < 0.01 vs FLS group

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通过Western blot方法，检测AA-FLS和FLS中的线粒体凋亡通路调控蛋白Bcl-2和Bax的表达差异。实验结果显示(Fig8、9)，与正常组大鼠FLS比较，AA-FLS中的Bcl-2相对表达量增高，差异有显著性(P < 0.01)；Bax的相对表达量呈下降趋势，但结果差异不具有统计学意义(P=0.050 4)。

Fig.8 Expressions of Bcl-2 and Bax in AA-FLS

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Fig.9 Reactive protein expressions of Bcl-2 and Bax in AA-FLS and FLS(±s) **P <

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Western blot结果显示，AA-FLS中的Pro-caspase-3蛋白的表达量与正常FLS相比较出现增高现象，但差异无统计学意义；本实验中发现，正常FLS细胞中未表达Cleave-caspase-3蛋白(Fig10)。

Fig.10 Reactive protein expression of Caspase-3 in AA-FLS and FLS

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目前对FLS细胞的原代培养主要有组织块法和胶原酶法^[6]。在用组织块法进行原代培养时，由于组织块与培养皿的贴附不牢，容易脱落；组织块大小不易控制，细胞不易从组织块中爬出，大量的细胞间物质会使培养周期延长，极易污染，成功率不高。本实验中采用胶原酶法分离获取原代FLS细胞，需注意分离剪取大鼠滑膜组织时，用PBS缓冲液洗去滑膜组织上的血和油脂，尽量剪碎滑膜物质，胶原酶消化细胞间物质，使FLS细胞释出。使用胶原酶消化滑膜组织，不使用胰酶与胶原酶的混合溶液，因胰酶对细胞损伤较大，使细胞爬出较慢，且爬出后细胞状态不佳。

原代培养初期，FLS细胞增殖缓慢且混有大量巨噬样滑膜细胞，可利用巨噬样滑膜细胞与FLS细胞的贴壁性差异、消化时间不同以及巨噬样滑膜细胞在体外的增殖速度极慢等特性，通过传代纯化FLS细胞。经过传代至第3代之后的FLS细胞增殖速度明显加快，由原代至第2代的5~7 d周期缩短为1~2 d的周期。第5代之后的FLS细胞增殖变慢，细胞出现老化、空泡，变形等现象，贴壁性变差，细胞活性逐渐降低，因此宜使用第3~5代的FLS细胞进行实验。我们通过免疫细胞化学的方法测定细胞对Vimentin和CD68的表达，结合细胞来自于滑膜组织以及细胞形态学的观察，从而鉴别细胞类型。Vimentin为成纤维细胞的特殊标志物，本实验中免疫细胞化学的结果显示，通过胶原酶法分离获得的细胞Vimentin表达阳性，而CD68几乎不表达，证实所培养细胞为滑膜成纤维细胞。

RA是一种多系统的慢性疾病，发病原因至今尚未明确。该病好发于手、腕、足等小关节，对称分布，RA患者会出现不同程度的畸形，是人类致残的主要原因之一^[7]。FLS参与了RA病程的各个阶段^[8]。异常活化的RA-FLS增殖活跃并且具有抗凋亡的特性，是导致滑膜组织增生的主要原因；各种抗原通过识别结合RA-FLS表面的Toll样受体，触发免疫应答，激活下游信号通路；活化的RA-FLS释放趋化因子，趋化白细胞进入滑膜组织；分泌大量促炎性细胞因子，诱发滑膜炎症；RA-FLS对软骨进行黏附，释放基质金属蛋白酶MMPs降解细胞外基质；诱导破骨细胞的激活与分化，最终骨侵蚀和骨关节的破坏^[9]。对RA-FLS的细胞周期测定发现，细胞G₂期很短，在无刺激因子干预的条件下呈良性增殖特点^[10]。体外培养RA、骨关节炎(osteoarthritis,OA)和创伤性关节炎患者的FLS细胞并比较3种细胞的增殖活性，RA-FLS的增殖程度较OA组和创伤性关节炎组增高^[11]。Perlman等^[12]取RA和OA患者的滑膜组织进行抗凋亡蛋白Bcl-2的表达测定，Bcl-2在RA患者的滑膜组织中呈高表达，尤其是在CD68阴性表达的位置，即RA患者成纤维样滑膜细胞的Bcl-2表达水平升高，出现凋亡抑制的特性。TNF-α和IL-1β是RA发病过程中的重要细胞因子，不仅能引起和加重炎症反应，还能激活细胞通路刺激FLS细胞增殖，参与了软骨及骨的破坏过程^{[13, 14]}。临床研究表明^[15]，RA患者血清中的TNF-α和IL-1β含量高于正常人的水平。有实验证明，用RA患者的滑液与正常的FLS细胞共同培养，细胞所分泌的TNF-α和IL-1β水平明显升高，提示活化的RA-FLS细胞可分泌高水平的促炎性细胞因子。因此，在临床病理上RA病人的FLS表现为类肿瘤样异常增殖、抗凋亡、释放高水平的促炎性细胞因子的特性。

佐剂型关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠与RA患者在临床表现和病理上有相似或相近的特征，该模型复制方法简便、可重复性强、成模率高，经济实用，是RA的理想动物模型。AA大鼠的FLS较RA患者的FLS更易获取，因此，我们对AA-FLS作为体外研究RA发病机制以及抗RA药物筛选的细胞模型可行性进行探讨。本实验通过AA大鼠模型获取的AA-FLS细胞状态良好，具有典型的成纤维细胞形态特征；由CCK-8实验结果可知，AA-FLS在传代培养d 6细胞数量能达到倍增，而正常大鼠FLS细胞数量倍增的时间在7 d以上，AA-FLS增殖活性明显高于正常大鼠FLS；AA-FLS细胞上清液中的TNF-α和IL-β水平高于正常大鼠FLS，提示AA-FLS可分泌高水平的促炎性细胞因子，介导炎症反应和对骨的破坏作用，同时这也是AA-FLS异常增殖的原因之一；对AA-FLS的凋亡状态分析发现，与正常大鼠FLS相比AA-FLS的细胞凋亡率明显降低，同时AA-FLS中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显上调，而Bax的相对表达量有下降的趋势，提示AA-FLS的线粒体凋亡通路受到抑制而呈现抗凋亡的特性。通过实验结果发现，AA-FLS在细胞增殖、细胞因子释放和细胞凋亡等方面均表现出与RA-FLS相似相近的生物特性，因此，AA-FLS可作为体外筛选抗RA药物的细胞模型。

(致谢：本实验在南方医科大学中医药学院中药药理实验室完成，感谢邓秋狄和白殊同对文章相关工作的支持。)