长期高脂饮食可引发Ⅱ型糖尿病、肥胖、高血压、高血脂、心脏病等一系列胰岛素抵抗综合征，目前认为，高脂环境是诱发胰岛素抵抗的独立危险因素之一。肝脏是脂类代谢的重要靶器官，也是胰岛素作用的主要器官，肝脂代谢失调是引起机体代谢异常，导致胰岛素抵抗的重要原因之一^{[1, 2]}。氧化苦参碱是豆科植物苦参的主要生物碱之一，主要用于乙肝、脂肪肝的治疗。本实验采用高脂喂养ApoE^-/-小鼠建立胰岛素抵抗模型，研究高脂喂养后对肝脂质代谢相关蛋白(脂质转运、脂质氧化和脂质合成蛋白)基因表达的变化，探讨氧化苦参碱干预对胰岛素抵抗小鼠脂代谢的作用机制。

氧化苦参碱(苦参素胶囊)购于正大天晴药业股份有限公司；胰岛素放射免疫试剂盒购自上海研晶生物公司；脂蛋白酯酶(LPL)、脂肪酸转位酶(FAT/CD36)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)、解偶联蛋白2(UCP2)、胆固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶 (FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抗体均购自Abcam公司；引物由上海生工生物公司合成。

DFM-96型放射免疫γ计数器购自众成机电技术公司；7300荧光定量PCR仪购自ABI公司；凝胶成像分析仪，购自美国Biorad公司。

SPF级C57BL/6J小鼠17只、SPF级ApoE^-/-小鼠68只，均为♂，18~20 g，由北京大学医学部提供，许可证号SCXK(京)2011-0012。饲养于屏障系统，光照12 h/d，温度20～26℃，相对湿度40%～70%。

基础饲料热量: 脂肪10.3%，蛋白质24.2%，碳水化合物65.5%；高脂饲料热量:脂肪59.8%，蛋白质20.1%，碳水化合物20.1%。

17只C57BL/6J小鼠设为正常组(NC)，给予基础饲料；68只ApoE^-/-小鼠设为高脂组，给予高脂饲料，每周测定小鼠体重，喂养16周后，随机分为4组：模型组(IR)、氧化苦参碱低剂量组(OXYL、25 mg·kg^-1·d^-1)、中剂量组(OXYM、50 mg·kg^-1·d^-1)、高剂量组(OXYH、100 mg·kg^-1·d^-1)，连续给药8周，模型组和正常组给以纯水。给药结束后，各组随机取7只小鼠进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验^[3]，计算葡萄糖输注率(GIR)，评价胰岛素敏感性。剩余10只小鼠采集血清、肝，-80℃保存备用。

采用全自动生化分析仪检测空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、脂肪酸(FFA)，放射免疫法检测空腹胰岛素(FINS)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。

肝组织匀浆后，TRIzol法提取总RNA，按照说明书进行反转录，荧光定量PCR仪进行扩增。引物序列：

LPL引物：上游：5′-AACTGCCACTTCAACCACAG-3′，下游：5′-CCAACTCTCATACATTCCCGT-3′，产物片段 78 bp；FAT/CD36引物：上游：5′-ACCAGAAATAGACCCTTGTGA-3′，下游：5′-ATGTGTGTGAGAGTTGAAACG-3′，产物片段145 bp；CPT1引物：上游：5′-TTATCGTGGTGGTGGGTGT -3′，下游：5′-CGCTCACAATGTTCTTCGTCT-3′，产物片段132 bp； UCP2引物：上游：5′-GATACTCTCCTGAAAGCCAACC-3′，下游：5′-CGAAGGCAGAAGTGAAGTGG-3′，产物片段64 bp；SREBP-1c引物：上游:5′-CAAAGAGGAGATTGGCATTG-3′，下游：5′-TGCGTGTGGAGAAGTAGATGT-3′，产物片段86 bp；FAS引物：上游:5′-TCGCCTATGGTTGTTGACC-3′，下游：5′-ATGGTTTCACGACTGGAGG-3′，产物片段132 bp； ACC引物：上游:5′-CAGGTTCTTTGTTCGTGCG-3′，下游：5′-CTTCCAGGAGCAGTCGTTC-3′，产物片段101 bp； GAPDH引物：上游：5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3′，下游：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′，产物片段138 bp；以GAPDH为内参基因，采用2^-△△Ct 法计算目的基因相对表达量。

肝组织匀浆后，提取总蛋白，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干转膜法转膜至PVDF膜，洗膜，加入一抗孵育，洗膜，加入相应的二抗反应，发光。对条带进行扫描，软件分析条带的吸光度值，以目的条带和内参照吸光度值的比值用于统计分析。

用SPSS 13.0统计软件分析数据，各项数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两组间各指标比较采用t检验。

与正常组相比，模型组小鼠体重(BW)、FBG、TC、TG、FFA、FINS、HOMA-IR均明显升高(P < 0.05)。与模型组相比，氧化苦参碱组TC、TG、FFA、HOMA-IR均明显降低(P < 0.05)，中、高剂量组BW、FBG、FINS明显降低(P < 0.05)。见Tab1。

与正常组相比，模型组小鼠GIR明显降低(P < 0.05)，与模型组比较，氧化苦参碱组GIR明显升高(P < 0.05)。见Tab2。

与正常组相比，模型组小鼠肝LPL、FAT/CD36 mRNA和蛋白表达均明显升高(P < 0.05)。与模型组相比，高剂量组 LPL、FAT/CD36 mRNA和蛋白表达均明显降低(P < 0.05)。中剂量组LPL、FAT/CD36蛋白表达均明显降低(P < 0.05)。见Fig1。

Fig.1 mRNA(A) and protein expression(B)of LPL,FAT/CD36 among groups 1.NC;2.IR;3.OXYL;4.OXYM;5.OXYH.*P < 0.05 vs NC group；#P < 0.05 vs IR group

图选项

与正常组相比，模型组小鼠肝CPT1 mRNA和蛋白表达明显降低、UCP2 mRNA和蛋白表达明显升高(P < 0.05)。与模型组相比，氧化苦参碱组CPT1 mRNA表达明显上升、UCP2 mRNA表达明显降低(P < 0.05)。中、高剂量组CPT1蛋白表达上升，UCP2蛋白表达下降(P < 0.05)。见Fig2。

Fig.2 mRNA(A) and protein expression(B)of CPT1，UCP2 among groups 1.NC;2.IR;3.OXYL;4.OXYM;5.OXYH. *P < 0.05 vs NC group；#P < 0.05 vs IR group

图选项

与正常组相比，模型组小鼠肝SREBP-1c、FAS、ACC mRNA和蛋白表达均明显升高(P < 0.05)。与模型组相比，氧化苦参碱组SREBP-1c mRNA和蛋白表达均明显降低(P < 0.05)，氧化苦参碱组FAS mRNA表达均明显降低(P < 0.05)，中、高剂量组FAS蛋白表达均明显降低(P < 0.05)，高剂量组ACC mRNA和蛋白表达均明显降低(P < 0.05)。见Fig3。

Fig.3 mRNA(A) and protein expression(B)of SREBP-1c,FAS,ACC among groups 1.NC;2.IR;3.OXYL;4.OXYM;5.OXYH;*P < 0.05 vs NC group；#P < 0.05 vs IR group

图选项

胰岛素抵抗是高血脂、2型糖尿病、肥胖、高血压等代谢疾病的共同病理基础。因此，如能在早期对胰岛素抵抗进行干预和治疗，则可有效延缓或降低多种代谢性疾病的发生、发展。ApoE^-/-小鼠为载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠，具有高胆固醇的特性，常被用于动脉粥样硬化的研究。本研究采用高脂喂养ApoE^-/-小鼠，发现小鼠具备了高血糖、高血脂、高胰岛素血症等明显的胰岛素抵抗特征，同时钳夹试验也证实了高脂喂养的ApoE^-/-小鼠产生了明显的胰岛素抵抗，与金鑫等^[4]报道一致。氧化苦参碱治疗糖尿病并发症、脂肪肝、乙肝等已有大量报道^{[5, 6]}，给予氧化苦参碱干预8周后，可使小鼠体重降低，同时明显降低血糖、血脂、胰岛素，改善ApoE^-/-小鼠的胰岛素抵抗，提示了氧化苦参碱具有治疗糖尿病、心血管病等代谢性疾病的潜力。

肝脏是表现胰岛素抵抗的主要器官，也是合成、释放各种脂蛋白及脂代谢酶类的重要靶器官。脂代谢主要包括甘油三酯代谢、胆固醇及其酯的代谢、糖脂代谢等，其在肝中代谢主要过程为：(1)转运：含甘油三酯的脂蛋白在脂蛋白酯酶(LPL)作用下分解为游离脂肪酸，长链游离脂肪酸进一步在脂肪酸转位酶 (FAT/CD36)作用下进入肝细胞，转变为活性形式；如果发生紊乱，将导致脂肪酸代谢异常^{[7, 8]}。(2)氧化：在肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)作用下长链脂酰辅酶转运进入线粒体，在肝线粒体内氧化利用；(3)合成：肝细胞内亦可以合成一部分脂质。上述过程中每个环节的异常均可引起甘油三酯，继而诱导胰岛素抵抗引起多种代谢综合征疾病。

对肝细胞脂转运、氧化、合成3个方面对高脂喂养的ApoE^-/-小鼠导致胰岛素抵抗进行了机制探讨：(1)研究结果显示，肝组织中转运关键酶LPL、FAT/CD36在高脂喂养的ApoE^-/-小鼠中表达升高，表明血中的脂类在上调的转运蛋白酶作用下更多的进入肝组织，在胰岛素抵抗中发挥重要作用；(2)CPT1是线粒体β氧化的限速关键酶^[9]。其中CPT1在肝组织高表达，结果显示高脂喂养的ApoE^-/-小鼠肝组织中CPT1表达下降，表明下调的CPT1破坏了线粒体氧化脂肪酸能力，致使脂质沉积；UCP2是解偶联蛋白(UCPs)家族蛋白之一，是位于线粒体内膜的一类保守的家族蛋白，在激活剂如游离脂肪酸作用下，UCP2被活化，导致线粒体解偶联，降低ATP产生^[10]。本实验结果显示了胰岛素抵抗小鼠肝组织UCP2表达上升；(3)肝组织内脂质合成增加是促进肝细胞脂质沉积的重要机制之一。SREBP-1c是肝细胞内调控脂肪酸合成的转录因子，参与调控下游脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶等，控制脂肪酸的合成^[11]。研究表明高脂喂养的ApoE^-/-小鼠肝SREBP-1c及下游的FAS、ACC基因均表达升高，提示了高脂喂养可使ApoE^-/-小鼠肝脂质合成增加。

氧化苦参碱可以抑制肝脂转运蛋白LPL、FAT/CD36表达，调节线粒体氧化关键蛋白CPT1、UCP2表达，抑制合成蛋白SREBP-1c、FAS、ACC表达，从脂转运、氧化、合成3个环节相关基因的表达较全面的调节肝脂质代谢，改善胰岛素抵抗，具有重要的临床价值及社会意义，也为治疗代谢性疾病提供了新的思路。

(致谢：本研究课题主要在河北省人民医院老年医学重点实验室完成，衷心感谢实验室人员和同学的帮助，尤其感谢宋光耀教授和王超副研究员的支持与指导！)