动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)病变是一种复杂的慢性血管炎症性疾病，血管壁的内皮细胞、平滑肌细胞、炎症细胞和血小板功能均有改变[1]。机体的增龄变化、有害代谢产物的堆积以及氧化应激产物增加，均是导致动脉粥样硬化的危险因素。大量研究显示ox-LDL能够损伤血管内皮细胞，促进与动脉粥样硬化的发生[2, 3]。ox-LDL能够刺激血小板活化，促进血栓形成。活化的血小板通过释放细胞因子等炎症蛋白，促进动脉粥样硬化的血管炎症反应。
白藜芦醇(resveratrol，RSV)是多酚类物质，在葡萄籽和红酒中有较高的含量。研究发现[4, 5]，RSV是天然的抗氧化剂，具有增加细胞内保护分子Sirt1表达，抗炎和抑制血栓形成的作用。Sirt1是近年来医学研究十分关注的细胞内源性保护性分子，在调节细胞能量代谢与长寿中起十分重要的作用[6]。动物实验研究表明，限制小鼠热量摄取，能够降低小鼠的能量代谢水平，增加Sirt1的表达，延长小鼠寿命[7]。很多研究已经确认Sirt1与机体长寿相关，是一个长寿基因[8, 9]。研究也证实RSV是Sirt1的激动剂，RSV能够增加细胞内Sirt1表达，减轻有害刺激对细胞的损伤，具有多种生物学保护作用。然而，RSV是否能够抑制ox-LDL刺激的血小板活化尚不清楚。本研究重点观察了RSV对ox-LDL诱导的血小板聚集、ROS产生、以及PECAM-1表达的影响，并对相关的分子机制进行了探讨。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂白藜芦醇购自Sigma 公司，纯度为99% (货号:R5010)。抗PECAM-1、抗β-actin 抗体购自Santa Cruz 公司；抗Sirt1抗体购自Millipore公司；抗p38MAPK 和抗phospho-p38MAPK 抗体购自Cell Signaling 公司。辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、兔抗山羊二抗购自北京中杉金桥公司。活性氧检测试剂盒(S0033)购自碧云天生物技术有限公司。
1.2 ox-LDL的制备收集新鲜人血清，用梯度超速离心法分离低密度脂蛋白。使用5 μmol·L-1硫酸铜氧化低密度脂蛋白，37℃，10 h，加入1 mmol·L-1 EDTA终止氧化反应。然后用PBS(pH 7.3)4 ℃透析24 h。用0.22 μm的Millex滤器过滤，用BCA法测定LDL蛋白浓度，4℃储存。
1.3 制备洗涤血小板取健康正常人血液，1 200 r·min-1离心10 min，分离上清，得到富血小板血浆。加入TYRODE Buffer (138 mmol·L-1 NaCl,3.3 mmol·L-1 NaH2PO4,2.9 mmol·L-1 KCl,1 mmol·L-1 MgCl2,5.5 mmol ·L-1 glucose,20 mmol ·L-1 HEPES,pH 7.2)和 9 ∶1的ACD (2.5% trisodium citrate,2.0% glucose,1.5% citric acid)，2 mmol·L-1 EDTA，混匀，1 400 r·min-1离心10 min。弃上清，悬浮细胞。再次离心，获得洗涤血小板。将血小板悬浮液室温静置30 min后，进行实验。
1.4 血小板聚集测定使用Chrono-Log血小板聚集分析仪测定血小板聚集，血小板聚集率由血小板聚集分析仪的软件计算。取血小板悬浮液300 μL置于测定通道内，搅拌1 min，加入ox-LDL (0.1 g·L-1) 刺激血小板10 min； 药物干预组将100 μmol·L-1 RSV孵育血小板10 min，放入测定通道。搅拌1 min,再加入 ox-LDL (0.1 g·L-1)刺激血小板10 min，终止反应，获得血小板聚集曲线。
1.5 活性氧(ROS)测定使用活性氧检测试剂盒，将荧光探针DCFH-DA(1: 1 000)孵育血小板，37℃，30min，洗涤血小板3次。血小板细胞内的荧光强度用CARY Eclipse荧光分光光度计测定，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。阳性对照组用ox-LDL (0.1 g·L-1) 刺激细胞10 min,药物处理组用100 μmol·L-1 RSV孵育血小板10 min，再加入ox-LDL (0.1 g·L-1) 刺激细胞10 min，开始测定荧光强度。
1.6 Western blot方法检测蛋白表达分别用各种浓度的RSV(1、10、100 μmol·L-1)、p38MAPK 抑制剂SB203580(0.1、0.3、1 μmol·L-1)以及Sirt1抑制剂EX527(10、30、100 nmol·L-1)预孵育血小板10 min，加入ox-LDL(0.1 g·L-1)刺激血小板10 min,终止反应。采用BCA法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温下封闭PVDF膜2 h，洗膜3次。分别加入特异性抗体(PECAM-1、Sirt1、p38MAPK、phospho-p38MAPK、β-actin)，4℃，过夜。用TBS-T(100 mmol·L-1 Tris，150 mmol·L-1 NaCl，0.1% Tween，pH 7.2)洗膜3次，每次5 min。加入相应二抗(1 ∶10 000)，室温孵育2 h。用TBS-T洗膜4次，每次5 min。最后，加入ECL发光液，用凝胶成像仪成像。
1.7 统计学方法所有数据来源于至少4次独立的实验，数据以x±s表示，采用双尾单因素方差分析以及Student t检验。
2 结果 2.1 白藜芦醇对血小板聚集的影响血小板聚集分析显示，ox-LDL(0.1 g·L-1)刺激血小板诱导了轻度的血小板聚集，聚集率为14%(Fig1A)，而使用100 μmol·L-1白藜芦醇孵育10 min血小板后，血小板聚集受到抑制，聚集率为7%(Fig1B)。白藜芦醇的血小板聚集抑制率为50%，两组之间存在明显差异，差异具有统计学意义(P < 0.05)(Fig1C)。
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| Fig.1 Effect of RSV on platelet aggregation induced by ox-LDL A: ox-LDL induced platelet aggregation; B: RSV inhibited platelet aggregation induced by ox-LDL; C: Statistical analysis of platelet aggregation. Data were representatives of three independent experiments. #P<0.05 vs ox-LDL-treated group. |
ox-LDL 为氧化型脂质产物，能够诱导细胞的氧化应激及炎症反应。结果显示，ox-LDL (0.1 g·L-1) 刺激血小板ROS产生增加了11.5倍，与正常对照组比较，两组之间差异具有统计学意义，P < 0.05。白藜芦醇处理的血小板与ox-LDL组比较，ROS产生减少了3.2倍，两组之间差异具有统计学意义，P < 0.05(Fig2)。
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| Fig.2 Effects of RSV on ROS production in ox-LDL-stimulated platelets ROS product was measured by fluorescence spectrophotometer in RSV-treated and ox-LDL-stimulated platelets. Data were representatives of four independent experiments. ox-LDL increased ROS level in platelets. RSV significantly decreased ROS level in ox-LDL-stimulated platelets.#P < 0.05 vs non-ox-LDL-treated group; *P < 0.05 vs ox-LDL-treated group. |
Platelet endothelial cell adhesion molecule-1(PECAM-1)是血小板内皮细胞黏附分子，在血管内皮细胞损伤时促进血小板与内皮细胞的黏附反应。结果显示，ox-LDL刺激血小板后PECAM-1表达增加，而白藜芦醇以剂量依赖的方式抑制了PECAM-1表达，与ox-LDL组比较，二者差异具有统计学意义(Fig3)。
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| Fig.3 Effects of RSV on PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets A: RSV suppressed PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets; B: Densitometry analysis of PECAM-1 expression. Data were representatives of four independent experiments. #P<0.05 vs non-ox-LDL-treated group; *P<0.05 vs ox-LDL-treated group. |
研究已经提示白藜芦醇是Sirt1的激活剂，本研究观察了白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板活化时Sirt1的变化。当ox-LDL (0.1 g·L-1)刺激血小板时Sirt1的表达下降了18%，与对照组比较，两组之间差异具有统计学意义，P < 0.05。与ox-LDL组比较，白藜芦醇(1、10、100 μmol·L-1)以浓度依赖的方式恢复了Sirt1的表达(Fig4A)。此外，我们观察白藜芦醇单独处理对血小板Sirt1表达的影响。结果显示，各种浓度的白藜芦醇(1、10、100 μmol·L-1)孵育血小板 10 mim,各组细胞Sirt1的表达没有明显变化(Fig4B)。这一结果提示,ox-LDL刺激血小板时保护性分子Sirt1受到损伤，出现了表达降低的变化，而白藜芦醇能够逆转这一现象。
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| Fig.4 Effects of RSV on Sirt1 expression in platelets A, B: RSV recovered Sirt1 expression in ox-LDL-stimulated platelets and densitometry analysis. C, D: RSV along had no effect on Sirt1 expression in non-ox-LDL-stimulated platelets and density analysis. Data were representatives of four independent experiments. #P < 0.05, statistically significant differences from without ox-LDL-treated platelets; *P < 0.05, statistically significant differences from platelets treated with ox-LDL alone. |
EX527是Sirt1特异性抑制剂，为了分析白藜芦醇抑制ox-LDL刺激血小板ROS产生及PECAM-1表达是否与Sirt1相关，以及Sirt1是否调控ROS产生及PECAM-1表达。我们使用了不同浓度的EX527(10、30、100 nmol·L-1)处理血小板。结果显示，在一个高浓度100 nmol·L-1 EX527处理的血小板ROS产生明显增加,与ox-LDL刺激组比较，二组之间差异具有统计学意义(P < 0.05)(Fig5A)。同样EX527处理的血小板PECAM-1表达也明显增加(P < 0.05)(Fig5B，C)。这一结果提示，病理条件下增加的ROS产生以及PECAM-1表达可能与Sirt1表达/活性降低相关联。
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| Fig.5 Effects of EX527 on ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets A: EX527 increased ROS level in ox-LDL-stimulated platelets; B: EX527 increased PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets; C: Densitometry analysis of PECAM-1 expression. Data were representatives of four independent experiments. #P < 0.05, statistically significant differences from non-ox-LDL-treated platelets; *P < 0.05, statistically significant differences from platelets treated with ox-LDL alone. |
先前的研究表明，p38MAPK参与多种血小板诱导剂刺激的血小板活化，如胶原(collagen)、凝血酶(thrombin)和ADP [10]。本研究我们观察了ox-LDL刺激血小板后p38MAPK的影响。结果显示，ox-LDL刺激血小板后p38MAPK磷酸化水平增加了2.4倍，与对照组比较有明显差异(P < 0.01)。白藜芦醇(100 μmol·L-1)明显抑制了p38MAPK的磷酸化(P < 0.05)(Fig6)。
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| Fig.6 Effects of RSV on p38MAPK phosphorylation in ox-LDL-stimulated platelets A: RSV suppressed p38MAPK phosphorylation in ox-LDL-stimulated platelets; B: Densitometry analysis of p38MAPK phosphorylation. Data were representatives of four independent experiments. ##P<0.01 vs non-ox-LDL-treated group; *P<0.05 vs ox-LDL-treated group. |
为了确认白藜芦醇降低ROS产生以及PECAM-1表达的药理作用是否与抑制p38MAPK相关，我们使用p38MAPK的抑制剂SB203580，分析其对ox-LDL刺激血小板ROS产生和PECAM-1表达的影响。我们在预实验中确认1 μmol·L-1 SB203580能够完全抑制p38MAPK磷酸化。结果显示，1 μmol·L-1 SB203580不能抑制ox-LDL刺激的血小板ROS产生(Fig7A)。进一步，我们观察了SB203580对PECAM-1的影响。结果显示，与ox-LDL组比较，SB203580(0.1、0.3、1 μmol·L-1)明显抑制了ox-LDL刺激血小板PECAM-1的表达，两组之间差异具有统计学意义(P < 0.05)(Fig7B，C)。这一结果提示，p38MAPK参与调控PECAM-1表达，但对ROS产生无明显影响。白藜芦醇抑制ox-LDL诱导血小板过表达PECAM-1可能与抑制p38MAPK磷酸化相联系。
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| Fig.7 Effects of SB203580 on ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets A: Statistical analysis of relative ROS level; B: SB203580 inhibited PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets; C: Densitometry analysis of PECAM-1 expression. Data were representatives of four independent experiments. #P < 0.05, statistically significant differences from without ox-LDL-treated platelets; *P < 0.05, statistically significant differences from platelets treated with ox-LDL alone. |
血小板活化在动脉粥样硬化血栓形成中是一个关键的环节，然而，近年大量研究显示，血小板在动脉粥样硬化的早期炎症过程中通过释放炎症介质，促进动脉粥样硬化的血管炎症。机体脂质代谢失调导致血脂成分增加，循环中的ox-LDL增加，不仅损伤内皮细胞，同时也能影响血小板功能。最近，我们以及其他的研究均证实，ox-LDL能够使内皮细胞炎症蛋白表达增高，也能促进血小板的聚集。因此，抑制ox-LDL损伤内皮细胞和血小板活化，对于防治动脉粥样硬化血管炎症和血栓形成具有重要意义。血小板是由骨髓巨核细胞脱落而成的无核细胞，近年研究发现，血小板有丰富的mRNA存在，具有合成蛋白的能力。最近，Denis等[11]报告，血小板含有剪接体和小核RNA以及mRNA前体，在血小板活化时能够转化为成熟mRNA，促进血小板炎症蛋白表达。我们的结果也证实血小板活化时炎症蛋白表达增加。
白藜芦醇又称为芪三酚，主要来源于葡萄、虎杖、桑椹等植物，具有抗氧化及抗炎的作用。动物实验提示[12]，白藜芦醇能够改善高热量高胆固醇饮食引起的内皮损伤。白藜芦醇的抗氧化作用可能与增加细胞内Sirt1表达相关[13, 14]。在体实验研究表明，通过热量限制和运动等方式可以促进Sirt1表达[15]。然而，Sirt1对血小板功能的调控尚不清楚。我们的结果提示，白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激的血小板聚集，降低血小板ROS产生和PECAM-1表达，这些药理作用与增加血小板Sirt1表达相关。
p38MAPK为MAPK家族的重要成员，不仅参与细胞的生存、分化和凋亡，还在炎症、氧化应激反应中起有重要作用。研究发现[16]，白藜芦醇可以抑制巨噬细胞的凋亡，与p38MAPK通路有关。我们的结果显示，抑制p38MAPK磷酸化能够减少ox-LDL刺激血小板炎症蛋白PECAM-1表达，但对ox-LDL诱导的ROS产生无明显抑制作用。在生理条件下，活性氧(reactive oxygen species，ROS)作为第二信使，参与细胞代谢，保持正常的细胞功能。然而，过高水平ROS能够导致细胞发生氧化应激反应。因此，ROS也被认为是氧化应激反应的病理产物和动脉粥样硬化的危险因素[17, 18]。本研究发现，ox-LDL刺激血小板之后，血小板发生聚集，ROS水平随之升高，而白藜芦醇部分地降低了ROS水平。由于细胞内ROS产生的途径较复杂，线粒体代谢、花生四烯酸代谢、nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)等均是ROS的重要来源。我们的结果提示尽管白藜芦醇减少ROS产生，但抑制效果是不完全的，确切的分子机制还有待于进一步研究。
综上所述，白藜芦醇能够降低ox-LDL诱导的血小板聚集、减少ROS产生，并降低PECAM-1的表达。其分子机制与增加Sirt1的表达相关。此外，白藜芦醇抑制PECAM-1表达与抑制p38 MAPK磷酸化相关。本研究提出了白藜芦醇改善血小板功能的实验依据，对临床预防治疗血栓性疾病，改善血管细胞功能具有重要的参考价值和科学意义。
(致谢：本文在北京老年医学研究所免疫室完成，在此加以致谢！)
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