大黄是蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum’ Maxim. ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎，2010版中国药典介绍大黄具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效。大黄素(emodin)是大黄的主要有效成分之一，有研究发现大黄素具有抗炎、降糖、降脂等作用，并能改善胰岛素抵抗，具有治疗2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的潜在价值[1, 2, 3]。
葡萄糖转运体4(glucose transporter type 4,GLUT4)是脂肪细胞和肌细胞摄取葡萄糖的重要转运体[4]，并受AMP依赖的蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的调控。激活AMPK或PPARγ均可促进细胞编码GLUT4基因和GLUT4蛋白向细胞膜转位，是治疗T2DM的重要靶点[5, 6, 7]。课题组前期发现，大黄素对链脲佐菌素(STZ)诱导T2DM大鼠的胰岛素有增敏作用，并明显上调T2DM大鼠皮下脂肪组织细胞膜上GLUT4蛋白的表达[8]，但对其药理作用的分子机制尚不明确。本研究进一步从AMPK和PPARγ途径探讨大黄素对脂肪细胞葡萄糖摄取的作用机制。
1 材料 1.1 实验动物与细胞株♂ Wistar大鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002],由福建中医药大学实验动物中心饲养；小鼠3T3-L1成纤维细胞(中国科学院上海生命科学研究院)。
1.2 药品与试剂大黄素(纯度 ≥ 98%，陕西森弗生物技术有限公司，货号：20111120006)；Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit(美国Fermentas公司)；RNeasy® Mini Kit(德国Qiagen公司，货号：74104)；6-NBDG(Sigma-Aldrich，货号：72987)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；GW9662(Sigma-Aldrich公司，货号：M6191)；Compound C(Sigma-Aldrich公司，货号：P5499)；抗体AMPKα1/2(Santa Cruz公司，货号：sc-25792)、p-AMPKα1/2(Santa Cruz公司，货号：sc-33524)、PPARγ(Santa Cruz公司，货号：sc-7273)、GLUT4(Santa Cruz公司，货号：sc-7938)、IRS-1(Santa Cruz公司，货号：sc-559)和p-IRS-1(Santa Cruz公司，货号：sc-33956)；小鼠18S rRNA探针引物(货号：4319413E，Applied Biosystems)。
1.3 仪器凝胶成像分析系统(Bio-Rad，型号：ChemiDoc XRS+)，PCR仪(Bio-Rad，型号：C1000)，荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，型号：7900HT)，高速台式冷冻离心机(Thermo Fisher，型号：Primo R)。
2 方法 2.1 细胞诱导及处理方法3T3-L1前脂肪细胞接种到24孔板中，培养于37 ℃、5% CO2培养箱中。用第1诱导液(10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM，0.5 mmol·L-1异丁基甲基黄嘌呤，1.0 mg·L-1胰岛素和1.0 μmol·L-1地塞米松)培养细胞48 h，更换为第2诱导液(10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM，1 mg·L-1胰岛素)培养16 d，采用油红O染色法染色观察细胞内有油滴聚集，即表示3T3-L1细胞已诱导分化为成熟的脂肪细胞。经10 μg·L-1 LPS干预24 h后，实验分为Control组、Emodin给药组(1、10、50 μmol·L-1)，收集细胞检测各项指标。同时，3T3-L1脂肪细胞经10 μg·L-1 LPS干预24 h，分为Control组、Emodin组、GW9662(5 μmol·L-1)+Emodin组、Compound C(10 μmol·L-1)+Emodin组。各组加入20 μmol·L-1葡萄糖类似物6-NBDG培养30 min。吸去培养液，用PBS洗涤细胞3遍，加入含1%曲通X-100的0.1 mol·L-1 pH 10磷酸钾缓冲液70 μL，避光裂解细胞10 min后，加入30 μL DMSO，轻轻摇动，使其与裂解液充分混匀后，用激发波长466 nm和发射波长540 nm荧光检测每孔荧光强度。
2.2 动物造模及处理方法STZ诱导T2DM模型的方法参照Lai等[9]的报道。♂ Wistar大鼠(200±20) g经适应性喂养后，改换高脂饲料饲养6周。经腹腔注射25 mg·kg-1 STZ，4周后检查大鼠空腹血糖(FBG)水平，FBG>7.8 mmol·L-1的大鼠视为T2DM模型。实验大鼠随机分为Control组和大黄素给药组，给药组每天灌胃大黄素100 mg·kg-1，Control组灌胃等体积的0.5% Na-CMC，连续灌胃21 d，并观察大鼠每天的体重变化和进食情况。d 21 取内脏脂肪组织进行后续实验。
2.3 Real-time PCR检测mRNA的表达按照QIAGEN RNeasy® Mini Kit试剂盒的操作步骤提取动物组织或细胞总RNA，用Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行逆转录为cDNA。PCR反应以cDNA为模板，反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃预变性15 s，退火60℃ 30 s，40个循环。每个实验重复处理3批样品，每批样品分别以同一批样品的内参计算ΔΔCt，以2-ΔΔCt计算各组mRNA的表达量。ΔΔCt = 各组(Ct目的基因-Ct内参)-对照组(Ct目的基因-Ct内参)。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司参照GenBank合成。引物序列详见Tab1。
| Gene | Species | Primer sequences |
| GLUT4 | Mouse | 5′-CTTCTTTGAGATTGGCCCTGG-3′ 5′-AGGTGAAGATGAAGAAGCCAAGC-3′ |
| Adiponectin | Mouse | 5′-AAAGGAGAGCCTGGAGAAGC-3′5′-AAAGGAGAGCCTGGAGAAGC-3′ |
| chREBP-α | Mouse | 5′-CGACACTCACCCACCTCTTC-3′5′-TTGTTCAGCCGGATCTTGTC-3′ |
| chREBP-β | Mouse | 5′-TCTGCAGATCGCGTGGAG-3′5′-CTTGTCCCGGCATAGCAAC-3′ |
| Adiponectin | Rat | 5′-AATCCTGCCCAGTCATGAAG-3′5′-GGAACATTGGGGACAGTGC-3′ |
| GAPDH | Rat | 5′-TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC-3′5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′ |
用含1% PMSF的RIPA裂解液裂解动物组织或细胞，离心取上清液，用BCA法检测蛋白浓度，加1×上样缓冲液，100 ℃变性10 min。用SDS-PAGE凝胶进行电泳、转膜、封闭、4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗膜3遍后，孵育二抗2 h，用Bio-Rad凝胶成像系统进行ECL显影。
2.5 统计学处理实验数据用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有结果以 
± s表示，组间比较采用Student-t检验或one-way ANOVA进行统计。
诱导分化后的3T3-L1细胞，体积变大，多呈圆形，胞质内容丰富，用油红O染色可见红色脂滴富集细胞核周(Fig1)。表明3T3-L1脂肪细胞已经诱导分化成熟。
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| Fig 1 Differentiated 3T3-L1 adipocytes strained by oil red O (scale bar=50 μm) |
与Control组相比，大黄素给药组明显提高3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取，并提高细胞膜上GLUT4的mRNA及蛋白表达水平，且差异有显著性(P < 0.05)(Fig2)。
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| Fig 2 Emodin enhanced 6-NBDG uptake (A) and mRNA (B) and protein (C) expression of cell surface GLUT4 in 3T3-L1 adipocytes (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞Adiponectin、chREBP-α和chREBP-β的mRNA表达(P < 0.05)。同时，大黄素给药组也提高了3T3-L1细胞IRS-1蛋白磷酸化水平，且差异有显著性(P < 0.05)，见Fig3。
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| Fig 3 Emodin enhanced mRNA expression of Adiponectin (A), chREBP-α (C), chREBP-β (D) and protein expression of p-IRS-1/total IRS-1 (B) in 3T3-L1 adipocytes (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞AMPKα1/2蛋白磷酸化水平，且差异有显著性(P < 0.05)。同时，与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取。与Emodin组相比，Compound C组降低细胞对6-NBDG的摄取，而Compound C+Emodin组3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取也降低(P < 0.05)，见Fig4。
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| Fig 4 Emodin enhanced protein expression of p-AMPK/total AMPK (A) and enhanced 6-NBDG uptake and uptake was inhibited by compound C (B) in 3T3-L1 adipocytes (n=3) *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs emodin |
与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞PPARγ蛋白表达水平，且差异有显著性(P < 0.05)。同时，与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取。与Emodin组相比，GW9662组降低细胞对6-NBDG的摄取，而GW9662+Emodin组3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取也降低(P < 0.05)，见Fig5。
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| Fig 5 Emodin enhanced protein expression of PPARγ (A) and enhanced 6-NBDG uptake and uptake was inhibited by GW9662 (B) in 3T3-L1 adipocytes (n=3) *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs emodin |
与Control组相比，Emodin组可提高T2DM大鼠脂肪组织细胞膜上GLUT4的蛋白表达和Adiponectin的mRNA表达，且差异有显著性(P < 0.01)，见Fig6。
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| Fig 6 Emodin enhanced protein expression of cell surface GLUT4 (A) and mRNA expression of Adiponectin (B) in adipose tissue of T2DM rats (n=4) **P < 0.01 vs control |
与Control组相比，Emodin组可提高T2DM大鼠的AMPKα1/2的蛋白磷酸化水平，且差异有显著性(P < 0.01)，见Fig7。
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| Fig 7 Emodin enhanced protein expression of p-AMPK/total AMPK in adipose tissue of T2DM rats (n=4) **P < 0.01 vs control |
脂肪细胞是全身能量与代谢的关键调节者[10]。当血糖浓度升高时，胰岛素诱导脂肪细胞摄取葡萄糖转化为脂质。T2DM患者由于肝脏、脂肪和肌肉等组织的胰岛素抵抗，导致血糖持续升高[11]。因此，增加脂肪细胞的胰岛素敏感度和葡萄糖摄取是治疗T2DM的手段之一。
Adiponectin是内源性胰岛素增敏激素[12]，IRS-1是胰岛素受体的底物之一[13]，大黄素能够促进二者的表达，提示大黄素可通过激活Adiponectin和IRS-1,提高3T3-L1脂肪细胞对胰岛素的敏感度。chREBP-α和chREBP-β是体内脂肪生成和糖分解的转录调控因子[10]，chREBP的激活可促进葡萄糖向脂质转化。本实验研究结果显示，大黄素的降糖作用可能通过激活脂肪细胞chREBP的转录和促进脂肪细胞表面葡萄糖转运体GLUT4的葡萄糖转运实现的。同时，大黄素可激活3T3-L1脂肪细胞AMPKα1/2和PPARγ的表达，并且经AMPK和PPARγ抑制后，大黄素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取作用的影响明显减弱，表明大黄素促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取与AMPK和PPARγ的信号通路有关。
综上所述，大黄素可增加3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感度，促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取功能，发挥降血糖作用，其作用机制与激活Adiponectin及IRS-1，进而激活AMPK和PPARγ的信号通路有关。
(致谢：本实验在福建省中药学重点实验室完成，感谢实验室的老师对本实验的帮助与指导。)
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